A 3Dpf zebrafish lárvák nagy áteresztőképességű DNS-kivonása és genotipizálása Fin Clipping protokollal

Összegzés

A zebrafish-t megbízható genetikai modellorganizmusként használták az orvosbiológiai kutatások során, különösen a genetikai módosítási technikák megjelenésével. Lárva fenotípusok gyanúja esetén az extrakciós DNS és a genotípus azonosítása nehéz lehet. Itt leírjuk a zebrafish lárvák hatékony, a farokvágással végzett genotipizálási eljárását, már 72 órával a megtermékenyítés után.

Absztrakt

Bevezetés

A zebrafish (Danio rerio) egy gerinces organizmus, amelyet széles körben használnak modellként a betegség vizsgálatához, valamint az 1., 2., 3. terápiás hipotézis preklinikai vizsgálatához. Ezeknek az állatoknak rövid generációs ideje van, könnyen kezelhetők, magas a szaporodási sebességük, alacsony költségük, és könnyen genetikai manipulációnak vetik alá magukat a DNS 4 embrióba történő mikroinjekciójával. Az új transzgenikus és génszerkesztő technológiák, például a cink-ujj nukleázok (ZFN) 5, a TAL-szerű effektor nukleázok (TAPS) 6, 7 és a rendszeresen egymásba tarkított rövid palindrom ismétlődések (CRISPR)/CRISPR 9. klaszter (Case9) egyre növekvő fejlesztése révén A 8. ábrán a zebrafish készen áll arra, hogy drámai módon javítsa számos kóros állapot megértését. Ezeket a technológiákat arra használták, hogy célzott nyílásokat hozzanak létre mind a szomatikus, mind a csíra sejtekben a zebrafish-ban, hatékonyan bevonva a géntechnológiával módosított állatokat 8. A szakirodalom legújabb példái, ideértve az epilepszia és az anyagcserezavarok genetikai modelljeinek kidolgozását a zebrafish 3, 9, 10, 11, 12 .

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Jegyzőkönyv

Az állatokkal végzett eljárásokat jóváhagyták, és megfelelnek a Kanadai Állatgondozási Tanács és az Ottawai Egyetem Állatgondozási Bizottságának állat-gondozási irányelveinek.

  1. A boncolási felület előkészítése 9 cm-es Petri-csészefedél ragasztásával, belső felületén autokláv-szalaggal. Helyezze sztereomikroszkóp alá.
  2. A megtermékenyítés helye 3-5 nap (dpf) zebrafish lárvák után egy Petri-csészében, és ˜1,5 mM tricaine-ban altattunk embrióközegben x E3 1 (5 mM NaCl, KCl, 0,33 mM CaCl2, 0, 33 mM MgSO4, 0,17 mM, pH 7,2).
  3. Vágja le a P1000 pipetta hegyének végét ollóval vagy borotvapengével 2 mm átmérőig, hogy a dpf 3 lárva befogadja minimális igénybevétel mellett.

2. a zebrafish lárvák végső vágása

3. Genom DNS kivonás

  1. Zárja le a 96 lyukú PCR-lemezt, és centrifugálja a mintákat 1000 x g-nél 1 percig annak biztosítására, hogy az összes szűrőpapír el legyen merülve a NaOH-oldatban.
  2. A szövetek líziséhez melegítsük a mintákat egy hőciklerben 95 ° C-on 5 percig, majd hűtjük 4 ° C-on 10 percig.
  3. Adjon minden mintához 6 μl 500 mM Tris-HCl-t (pH 8,0). Örvény.
  4. Röviden centrifugáljuk a lemezt 1500 xg sebességgel, 5 percig szobahőmérsékleten.
  5. Használjon 1,5 μl DNS-felülúszót PCR-reakciónként.
  6. Készítsen elő egy PCR-t a lárvák genotípusának meghatározásához, a 1-2. táblázat.
    Megjegyzés: Ezt a protokollt két alkalmazásban tesztelték: multiplex PCR-reakciók, amelyek agaróz-9 gélek segítségével feltárják a genotípust, és heteroduplex cast assay (HMA), feltárva a genotípusokat poliakrilamid-gél (PAGE) segítségével. Elektroforézis 17 .

4. alternatív genomiális extrakció kelátgyantával

  1. Végezze el a 2.5. Lépést úgy, hogy az úszóval vágott szűrőpapírt hozzáad egy 96 üregű PCR lemezhez, amely 30 μl 5% -os kelátképző gyantát tartalmaz (sztirol-divinilbenzol kopolimer páros Iminodiacetate ionokat tartalmaz).
    Megjegyzés: Ezt a típusú gyantát gyakran használják szövetek lízisére és PCR-kész DNS gyors és hatékony előállítására 18 .
  2. Kövesse a 2.6-2.8 lépéseket az ábra szerint.
  3. Töltsük le a 96 üreges PCR-t, és röviden centrifugáljuk a mintákat, hogy az összes szűrőpapír beágyazódjon a kelátgyantába.
  4. A szövetek líziséhez a mintákat hőciklerben melegítsük 95 ° C-on 15 percig, majd hűtjük 10 ° C-on 4 ° C-ra.
    Megjegyzés: Ez a lépés lehetővé teszi a poláros gyanta gyöngyök lízisét és utólagos kötését a sejtkomponensekhez, miközben a DNS és az RNS oldatban marad.
  5. Röviden, centrifugáljuk a mintákat a pelletgyanta gyöngyökhöz, és kapjunk DNS-t a szuszpenzióban.
  6. A genotipizálási eljárás befejezéséhez kövesse a 3.5–3.6 lépéseket.

5. 1. alkalmazás: Multiplex PCR, majd Agarose Gel elemzés

6. 2. alkalmazás: Heteroduplex öntöttvas vizsgálat

  1. Készítse el a PAGE 12% -os géleket az 1,5 mm-es távtartó lemez és a 15 mintás fésű segítségével. Készítsen két PAGE gélt 12,21 ml ddH2O, 2,52 ml 10 x Tris/Borate/EDTA (TBE), 10 ml 30% akrilamid, 250 μl 10% ammónium-perszulfát (APS) és 20 μl tetrametil-etilén-diamin (TEMED) felhasználásával. Használjon 1 x TBE puffert (0,089 M Tris-HCl, 0,089 M bórsavat és 0,002 M tetraecetsavat (EDTA)) a pufferben.
  2. A PCR-termékeket 94 ° C-on melegítjük 5 percig.
  3. Hűtsük a csöveket jégen vagy a hőciklerben 10 percig, 4 ° C-on.
  4. Töltsön be 10 μL/PCR mintát és 8 μL molekulatömeg-markert.
  5. Futtassa a PAGE-ot 150 V 1 x TBE-vel függőleges elektroforézis rendszer alkalmazásával 1 órán át, vagy amíg a molekulatömeg-marker majdnem el nem éri az üveglap alsó vonalát.
  6. Az UV gél lehetővé teszi a kép különböző genotípusainak megkülönböztetését.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Reprezentatív eredmények

30 µL. A DNS kelátképző gyantával történő extrahálása hasonló hozamot eredményez, például átlagosan 0,5, 3,8 ng/µl DNS-t. A fin lárvákból összegyűjtött DNS ez a mennyisége elegendő minőségű PCR-kész genomiális DNS-t eredményez a genotípusok azonosításához. Minden DNS-minta felhasználható PCR ~ 30 amplifikációs reakciókban. A Gen1_FW és a Gen2_RV primerek alkalmazásával kapott amplifikációs termékek szintén felhasználhatók a 9 szekvenálására, amelyek azonosították az 5 bp beépülést homozigóta mutánsokban (aldh7a1 -/-) (3. ábra ). Sanger szekvenálást egy külső szolgálat hajtott végre annak ellenőrzésére, hogy a PCR-termékek alkalmatlanok-e erre az alkalmazásra. Az agaróz gél DNS-mintákkal megerősítették a homozigóta mutánsokat és WT-ket (n = 3). Magas pontszámot kaptunk 19 Phred-ről (> 30), ami kiváló minőségű olvasmányokat jelent, kivéve az első és az utolsó 40 bázispárt.