A citrinin előfordulása és kimutatása növényi eredetű élelmiszerekben - PDF ingyenes
A Müncheni Műszaki Egyetem Weihenstephan Táplálkozási, Területhasználati és Környezetvédelmi Tudományos Központjából, az Állategészségügyi Egyetem tanára - Prof. Dr. Dr. h.c. Johann Bauer Az Állati eredetű élelmiszerek Higiéniai és Technológiai Intézete nyújtotta be a Tej Higiéniai és Technológiai Tanszékének elnöke - Prof. Dr. Erwin Märtlbauer, a müncheni Ludwig Maximilians Egyetem Állatorvos-tanszéke A citrinin előfordulása és kimutatása növényi eredetű élelmiszerekben Nyitó disszertáció a müncheni Ludwig Maximilians Egyetem állatorvosi karának állatorvosi doktori cím megszerzéséhez, Claudia Barbara Schneider Münchenből, München 2007
Nyomtatás a Ludwig-Maximilians-Universität München állatorvosi karának engedélyével Dékán: Előadó: Társbíró: Univ.-Prof. Dr. E. P. Märtlbauer Prof. Dr. Märtlbauer jún. Prof. Dr. Deeg érettségi napja: 2007. február 9
A férjem és a két lányom
I. oldal Tartalom A Bevezetés. 1 B irodalom. 3 1 A citrinin fizikai és kémiai tulajdonságai. 3 2 Citrinintermelő gombák. 5 3 A citrinin előfordulása. 7 4 Toxikokinetika. 9 5 A citrinin biológiai tulajdonságai. 10 5.1 Hatások a mikroorganizmusokra. 10 5.2 Hatások makroorganizmusokra és sejtrendszerekre. 10 5.2.1 Citotoxicitás. 11 5.2.2 Nefrotoxicitás. 12 5.2.3 Genotoxicitás. 15 5.2.4 Karcinogenitás. 16 5.2.5 Embriotoxikus és teratogén hatások. 17 5.2.6 Kombinációs hatások más mikotoxinokkal. 17 5.3 Farmakológiai tulajdonságok. 18 6 Módszer a citrinin kimutatására. 19 C Anyag és módszerek. 20 1 anyag. 20 1.1 Mintaanyag. 20 1.2 Fogyóeszközök. 21 1.3 Fogyóeszközök. 21 1.4 Vegyszerek. 22 2 módszer. 22 2.1 Módszer kidolgozása a citrinin meghatározására gabonafélékben. 23 2.1.1. Az extrakció előzetes vizsgálata. 23 2.1.2 Előzetes vizsgálatok a tisztításhoz. 24 2.1.2.1 Folyadék-folyadék elválasztás. 24 2.1.2.2. Tisztítás szilárd fázisú extrakcióval. 30 2.1.2.3. Tisztítás immunoaffinitás-kromatográfiával. 33 2.2 A citrinin meghatározásának módszerei gyümölcs- és zöldséglében. 34
II. Oldal 2.3 Orientációs vizsgálatok a citrinin gyümölcslében való stabilitásáról 38 2.4 A citrinin meghatározása ázsiai ételekben. 38 2.5 A módszerek validálása. 39 2.6 A citrinin tömegspektrometriás meghatározása. 41 2.6.1 A gabonafélék LC-MS elemzése. 41 2.6.2 LC-MS/MS elemzés gyümölcs- és zöldséglevek, valamint ázsiai ételek esetében. 42 2.7 A kereskedelmi minták vizsgálata. 43 D eredmény. 45 1 A citrinin kimutatása és meghatározása ESI-MS vagy MS/MS alkalmazásával. 45 2 előzetes kísérlet a citrinin meghatározására szerves mátrixokban. 48 2.1 Gabonafélék. 48 2.1.1 Kivonás. 48 2.1.2 Tisztítás. 49 2.1.2.1 Folyadék-folyadék elválasztás. 49 2.1.2.2. Tisztítás szilárd fázisú extrakcióval. 52 2.1.2.3. Tisztítás immunoaffinitás oszlopokkal. 54 2.2 Gyümölcs- és zöldséglevek. 55 2.2.1 Az előzetes tesztek eredményei. 55 2.2.2 Előzetes tanulmányok a citrinin almalé stabilitásáról. 57 2.3 A módszer validálása. 58 3 A citrinin előfordulása az ételekben. 61 3.1 Gabonafélék. 61 3.2 Gyümölcs- és zöldséglevek. 62 3.3 Ázsiai ételek. 62 E megbeszélés. 63 F összefoglalás. 68 G Összegzés. 69 H Irodalomjegyzék. 70
III. Oldal Az ábrák felsorolása: 1. ábra: A citrinin szerkezeti képlete, A) p-kinon forma és B) o-kinon forma . 3 2. ábra: Egy standard oldat (5 ng/ml) LC-MS kromatogramjai (m/z 251) (fent) és egy citrinint tartalmazó kukoricaliszt minta (4,4 ug/kg, lentebb). 46 3. ábra: A citrinin tömegspektruma (ESI +, kúpfeszültség 30 V). 46 4. ábra: LC-MS/MS kromatogramok (m/z 249/175) standard oldatból (fent 1 ng/ml) és citrininnel mesterségesen szennyezett almalé-mintából (c: 0,1 ng/ml, lentebb). 47 5. ábra: A citrinin degradációs viselkedése almalében szobahőmérsékleten. 58
VI. Oldal Rövidítések listája aw érték vízi aktivitás BEN Balcan Endemikus Nephropathia BHK21 sejtek Babyhamster vesesejtek CHO-K1 sejtek Kínai hörcsög petefészek sejtek DNS Deoxiribonukleinsav (DNS: Deoxaribonukleinsav) EIA Enzim immunoassay (enzim immunoassay) g gyorsulás a gravitáció miatt (1g = 9,81 m/2) g gramm HCl sósav Hela sejtek Humán méhnyak karcinóma sejtek HEK293 sejtek Emberi embrionális vesesejtek HL-60 sejtek Humán promielocita leukémia sejtek HPLC Nagy teljesítményű folyadékkromatográfia HPRT Hypoxanthine-guanine-phosphoribosyl-transferase HTC-sejtek Hepatoma szöveti sejtek IAC Immunoaffinity kromatográfia IARC Nemzetközi Rákkutató Ügynökség im intramuszkuláris i.p. intraperitoneálisan i.v. intravénás kg testtömeg-kilogramm LC-MS folyadékkromatográfia-tömegspektrometria LC-MS/MS folyadékkromatográfia-tandem tömegspektrometria LD letaldóz LLC-PK1 Sertés vese sejtvonal MDBK sejtek Madin Darby szarvasmarha vesesejtek MeOH metanol perc perc ml milliliter mm millimoláris MPN Mikotoxikus sertés nephropathia m-rns hírvivő ribonukleinsav m/z tömeg/töltés n szám NADH nikotinamid adenin dinukleotid N 2 nitrogén nm nanomoláris ng nanogramm nn kimutathatatlan PBS-foszfát-pufferolt sóoldat p.o. per os
VII. Oldal ppb/milliárd ppm/millió RNS ribonukleinsav r-rns riboszomális ribonukleinsav RP fordított fázisú RNS ribonukleinsav s.c. szubkután SCE-testvér testvérkromatid-csere teszt TBME tercier-butil-metil-éter TLC vékonyréteg-kromatográfia UDS-vizsgálat nem tervezett DNS-szintézis (DNS-javítási szintézis) vizsgálat V79 sejtek hím kínai hörcsögök tüdőfibroblasztjai WHO Egészségügyi Világszervezet µg mikrogramm µm mikromoláris
Irodalom 6. oldal 2. táblázat: Aspergillus Penicilium Monascus citrinint termelő gombák (Cole és Cox, 1981; Betina, 1989, Roth és mtsai, 1990; Frank, 1992; Blanc és mtsai, 1995b, Wang és mtsai, 2005) Faj A. candidus A. flavipes A. niveus A. terreus P. canescens P. citroviridae P. citrinum P. claviforme P. expansum P. fellutanum P. implicatum P. janthinellum P. jenseni P. lividum P. palitans P. purpurrescens P. roqueforti P. spinolosum P. velutinum P. verrucosum M. floridanus M. lunisporas M. pallens M. pilosus M. purpureus M. ruber M. sangiuneus
Irodalom 19. oldal 6 A citrinin kimutatásának módszerei A többi mikotoxinnal összehasonlítva csak kevés adat áll rendelkezésre a citrinin táplálékban való előfordulásáról. Ez részben annak analitikai sajátosságainak köszönhető, hogy a toxin instabilitása a minta előkészítése során és az általa okozott erősen ingadozó visszanyerési arány (Wilson, 1994), valamint a kromatográfiás detektálásban kifejezett markolás problémásnak bizonyulhat (Dick, 1988). A citrinin kimutatását főként vékonyréteg-kromatográfia (TLC) (Blanc és mtsai, 1995a, b, Martins és mtsai, 2002, Gimeno, 1984), nagy teljesítményű folyadékkromatográfia (HPLC), UV (Phillips és mtsai, 1980) vagy fluoreszcencia detektálás ( Lepom, 1986, Reinhard & Zimmerli, 1999b, Schneweis és mtsai, 2001) és gázkromatográfia (GC) (Shu & Lin, 2002). és enzim immunvizsgálatokat (EIA) (Abramson és mtsai, 1996, 1999, Dietrich és mtsai, 1998, 1999, Vrabcheva és mtsai, 2000, Schmid, 2002) használunk.
Anyag és módszerek 20. oldal C Anyag és módszerek 1. Anyag 1.1 Mintaanyag Ebben a munkában elsősorban gabonát és gabonatermékeket, valamint gyümölcs- és zöldségleveket vizsgáltunk. Ezenkívül elemezték az egyes ázsiai ételeket. A mintákat élelmiszer-kiskereskedőktől szerezték be. Gabonafélék Összesen 380 mintát elemeztek citrinin jelenlétére. Ebből 279 gabona/gabonatermék és 69 kukorica/kukorica termék volt. Ezenkívül 19 hajdina/hajdina terméket és 13 rizsmintát vizsgáltak. Gyümölcs- és zöldséglevek A 98 elemzett gyümölcsléből 34 alma, 27 narancs, 7 szőlő, 8 ananász, 4 körte, 7 banán, 3 őszibarack, 4 multivitamin, 3 paradicsom és 1 mandarin juice volt. Ázsiai ételeket 2 mintát szakéborból és 2 hoi-sin szószt, valamint egy ázsiai fűszerpasztát vizsgáltak a citrinin jelenlétére. Mikológiai szempontból ártalmatlan mintaanyagot használtak a kimutatási módszerek kidolgozásához és validálásához. A minta anyagának mesterséges szennyezése citrinin standard oldatokkal történt.