A helyi proliferáció az elhízásban a makrofágok felhalmozódásához vezet a zsírszövetben

alanyok

absztrakt

A zsírszöveti makrofágok (ATM) felhalmozódása az elhízással összefüggő krónikus gyulladás jelentős jellemzője. Fontos az elhízás kialakulásának szabályozásában is. Szikár állatokban kisszámú rezidens ATM-sejt van elosztva az M2 makrofágnak tartott adipociták között. Elhízás esetén jelentősen megnövekedett makrofágok halmozódnak fel a zsírszövetben, és az elhalt adipociták körül kialakítják az úgynevezett "korona-szerű struktúrát" (CLS). 1, 2 Ezek a makrofágok M1 fenotípussal rendelkeznek, és különféle típusú gyulladásos citokinek, például TNF- és agr; ami az elhízás miatti gyulladás terjedéséhez és az anyagcsere-rendellenességek, például az inzulinrezisztencia kialakulásához vezet. 3, 4, 5

Hagyományosan a felhalmozódott ATM-eket a perifériás monocita migráció eredményeként tekintik gyulladásos körülmények között. A közelmúltban egyre több bizonyíték mutatta, hogy a szöveti makrofágok fenntartása valószínűleg független a keringő monociták feltöltésétől, sőt független a csontvelő prekurzoraitól. 6 Valójában a szöveti makrofágok különböző típusai képesek megújulni és lokálisan szaporodni a naiv állapotban, mint például a microglia, 7, 8, Kupffer, 9 és Langerhans sejtek. Akut gyulladásos állapotban, például parazitafertőzés során, a makrofágok helyi szaporodása fokozódik, és ezek a makrofágok alternatív módon aktivált makrofágok fenotípusait mutatják be, ezt a folyamatot Th2 citokinek irányítják. 11 Krónikus gyulladásos állapotokban, például az arteriosclerosisban, a makrofágok helyi szaporodása is előfordul, ami hozzájárul a makrofágok felhalmozódásához az artériák falain. Nemrégiben beszámoltak arról, hogy a makrofágok helyi szaporodása hozzájárulhat az elhízás felhalmozódásához az ATM-eknél. 13, 14

Eredmények

Az ATM felhalmozódása az elhízás korai szakaszában a makrofágok szaporodásával függ össze

proliferáció

A makrofágok felhalmozódása a zsírszövetben az elhízás korai szakaszában in situ proliferációval jár. ( a ) ND-vel és HFD-vel táplált egerek testsúlya (n = 10 egér mindegyik csoportban). A hibasávok az átlagértékeket ± SEM *** P + ATM-ek jelentik az eAT-ban ND vagy HFD egereken. Méretarány, 100 μm

A genetikai elhízás korai stádiuma az ATM-ek elterjedésével jár

Az elhízás bonyolult gén-környezet kölcsönhatások eredménye. A genetikailag öröklődő elhízás modelljében a leptin receptorhiányos egerek (lepra db/db egerek, általában db/db néven említik) nem csak az étrenddel kapcsolatos elhízást vizsgáltuk, hanem azt is, hogy a makrofágok in situ proliferációja Felhalmozás jár. db egér). Megállapítottuk, hogy a leprás db/db egerek ATM felhalmozódása a zsírszövetben (eAT és iAT) az elhízás korai szakaszában (7 hetesek) drámaian megnő heterozigóta alomtársaikéhoz képest (2a). Eközben a Ki67 + makrofágok nagymértékben megnövekedtek a 7 hetes leprás db/db egerek zsírszövetében (2b). EdU beépítési tesztet is végeztünk, és megállapítottuk, hogy a genetikai elhízás korai szakaszában (10 hetes) lényegesen több EdU-beépült makrofág figyelhető meg a lepra db/db egerek zsírszövetében (2c. És d. Ábra). Az előrehaladott genetikai elhízással rendelkező (30 hetes) egerekből származó EdU beépített ATM-ek százaléka szintén szignifikánsan magasabb volt, mint a sovány alomtársaké. Így a makrofágok szaporodása hozzájárul az ATM felhalmozódásához a genetikai elhízásban.

helyi

helyi

Összehasonlításképpen tovább elemeztük az eozinofilek kiméra szintjét a zsírszövetben. Az eozinofilek a myeloid sejtek egy másik alcsoportja, amelyekről kimutatták, hogy a perifériás vérből a zsírszövetbe vándorolnak, és fontos szerepet játszanak a glükóz homeosztázis fenntartásában, 15 amelyek nem szaporodnak elhízott vagy sovány egerekben (S1a és b kiegészítő ábra) ). . Az ATM-ekkel ellentétben az elhízott egerek zsírszövetében nyilvánvaló donor eredetű (CD45.1 +) eozinofileket figyeltek meg mind a korai szakaszban (8 hetes HFD), mind a késői stádiumú elhízásban (12 hetes HFD) (3d. Ábra). Emiatt megerősítettük, hogy az ATM felhalmozódását a rezidens makrofágok szaporodása váltja ki az elhízás korai szakaszában, és tovább segíti a monocita vándorlás az elhízás késői szakaszában.

Érdekes kérdést is felvetettünk: a makrofágok szaporodási ereje a hazai ATM-ekre korlátozódik-e, vagy megfigyelhető-e toborzott makrofágokban is? Ennek orvoslására 12 hétig EdU beépítési tesztet végeztünk a HFD-vel táplált kiméra egereken. Érdekes módon mind a CD45.2 +, mind a CD45.1 + -Edu beépített ATM-eket kimutatták a zsírszövetben (3e. Ábra), ami azt jelzi, hogy a makrofágok szaporodnak, függetlenül azok eredetétől. Így a rezidens és a toborzott makrofágok helyi szaporodása hozzájárul az ATM-ek felhalmozódásához.

A CCL2 felesleges a makrofágok felhalmozódásához az elhízás korai szakaszában

Annak alátámasztására, hogy a proliferáció, nem pedig a monocita vándorlás játszik döntő szerepet az ATM felhalmozódásában a korai elhízásban, elemeztük a CCL2 (MCP-1) helyi expresszióját a zsírszövetben, amely a monocita vándorlás központi kemoattraktánsa. van. Érdekes módon intracelluláris festés során azt tapasztaltuk, hogy a CCL2-t főleg a zsírszövetben lévő CD45-CD31-sztromális sejtek expresszálták, és nem CD45 + leukociták vagy CD31 + endoteliális sejtek. Valójában az elhízott egerek zsírszövetéből származó sejtek három populációjának egyikében sem észleltek megnövekedett CCL2 expressziót a sovány egerekéhez képest (4a. Ábra). Következésképpen a CCL2 szintje a szérumban nem változott az elhízás korai szakaszában (4b. Ábra). Az elhízás egy későbbi szakaszában (HFD> 12 hét) azonban szignifikánsan magasabb CCL2 szintet találtak a szérumban (4c. Ábra). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a CCL2 által kiváltott monocita migráció nem az ATM felhalmozódásának meghatározó tényezője az elhízás korai stádiumában, míg az ATM felhalmozódását az elhízás egy viszonylag későbbi szakaszában tudja szabályozni.

makrofágok

felhalmozódásához

A proliferatív ATM-ek előnyösen CLS-ben találhatók. ( a ) A Ki67 + ATM-ek lokalizációját mutató immunfluoreszcencia HFD-indukált elhízott egerekben. Nyílhegyek jelzik az ATM-eket a CLS-en kívül. Méretarány, 100 μm. ( ) A Ki67 + ATM-ek százaléka a CLS-ekben és a CLS-eken kívül, ahol 7 immunfluoreszcens képből 225 ATM-et kombináltak. *** A P + ATM-ek fokozatosan csökkentek az elhízás előrehaladásával együtt. Részletes elemzés kimutatta, hogy a RELM- & agr; a Ki67 + ATM-eknél jóval alacsonyabb, mint a Ki67 ATM-eknél (S2 kiegészítő ábra). TNF-? + Az ATM-eket először növelték, majd csökkentették az elhízás előrehaladtával. A Ki67 + TNF- & agr; + Az ATM hasonló a Ki67-hez - TNF- & agr; + ATM-ek (S3 kiegészítő ábra).

Az IL-4/STAT6 jelátvitel az ATM-ek elterjedésének fő mozgatórugója

Tovább vizsgáltuk az ATM szaporodásának mitogén ingereit. Kimutatták, hogy az IL-4, 11 M-CSF, 12 és CCL2 13 képes szabályozni a makrofágok helyi proliferációját. Amikor azonban megvizsgáltuk ezeknek a citokineknak az ATM-szaporodásra gyakorolt ​​hatását, azt tapasztaltuk, hogy sovány egerekben csak az IL-4 adagolása növelheti az ATM-proliferációt. 19 Amikor az IL-4-et intraperitoneálisan injektálták sovány egerekbe, a Ki67 + ATM-ek drámai növekedését figyelték meg (6a. Ábra). Miután receptorához kötődik, az IL-4 aktiválja a JAK1-et és a JAK3-at, majd az IL-4 által közvetített biológiai reakciók központi transzkripciós faktorának számító STAT6 foszforilezéséhez vezet. 20 Megállapítottuk, hogy az IL-4 indukálta ATM-ek proliferációja STAT6 hiányos egerekben súlyosan károsodott (6a. Ábra), ami arra utal, hogy az IL-4/STAT6 jelátvitel kritikus szerepet játszik az IL-4 által vezérelt ATM-ben. - Szaporodást jelez. Ennél is fontosabb, hogy HFD-s egerekben a Ki67 + ATM-ek százaléka STAT6-hiányos egerekben szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a WT-egereknél (6b. Ábra). Az IL-4/STAT6 jelátvitel tehát az ATM-ek elterjedésének mozgatórugója az elhízásban.

helyi

Az IL-4/STAT6 ösztönzi az ATM-ek terjedését. ( a ) Ki67 expresszió ATM-ekben WT és STAT6 -/- egerekből, amelyeket IL-4 és IL-4 antitestek komplexének tettek ki (az IL-4 biohasznosulásának in vivo kiterjesztése érdekében) vagy PBS-sel 48 órán keresztül kezelték. ( ) A WT és STAT6 -/- egerek Ki67 expressziója HFD-n ATM-ekben (n = 10 mindegyik csoportban). Megjelennek az átlagértékek ± SEM

vita

Az elhízás a krónikus gyulladást terjesztő és az inzulinrezisztenciát elősegítő ATM-ek felhalmozásához kapcsolódik. Korábbi jelentések kimutatták, hogy a vér monocita vándorlása hozzájárul a makrofágok beszivárgásához a gyulladt helyeken. 1, 16, 21 A legújabb bizonyítékok arra utalnak, hogy a helyi proliferáció is szerepet játszik az elhízott emberek ATM-felhalmozásának szabályozásában. 13., 14. Ennek a két eseménynek az elhízás progressziója során bekövetkezett ATM-felhalmozódáshoz való hozzájárulását azonban nem vizsgálták. Ebben a tanulmányban megmutattuk, hogy a rezidens makrofágok in situ proliferációja meghatározza az ATM felhalmozódását az elhízás korai szakaszában, míg a bevándorló monociták hozzájárulnak az ATM felhalmozódásához az elhízás viszonylag késői szakaszában. Ezenkívül mind a rezidens, mind a toborzott makrofágok szaporodnak az elhízott egerek zsírszövetében (összefoglalva a 7-ben).

felhalmozódásához

A makrofág-proliferáció és a monocita-toborzás hozzájárulásának sematikus ábrázolása az elhízás ATM-felhalmozásához. Szikár egerekben a rezidens makrofágok szunnyadnak a zsírszövetben, és az önmegújulás révén fenntartják a sejtesség alapvető szintjét. Az elhízás korai szakaszában ezek a rezidens makrofágok szaporodnak és ATM felhalmozódáshoz vezetnek, amelyet az adipociták és/vagy más immunsejtek által kibocsátott ingerek irányítanak. Az elhízás késői szakaszában az ATM felhalmozódását tovább növelik a monocitákból származó makrofágok, amelyek szintén képesek szaporodni. Ezek a szaporodó makrofágok mindig a CLS-ben lokalizálódnak és körülveszik az apoptotikus adipocitákat. A vörös magok azt jelzik, hogy a makrofágok szaporodnak

Korábban beszámoltak arról, hogy a perifériás monocita beszivárgás fontos szerepet játszik az elhízás felhalmozódásában az ATM-eknél. 1 A monocita-toborzás közvetítésének egyik kulcs kemokinjeként felvetették, hogy a CCL2 (MCP-1) az elhízásban az ATM felhalmozódását közvetíti. Egy másik jelentés azonban azt mutatja, hogy CCL2 hiányában a makrofágok felhalmozódásának csökkenését nem figyelték meg a zsírszövetben. 22 Ezek az ellentmondásos eredmények arra utalnak, hogy a monocita vándorlás nem az egyetlen módja annak, hogy az elhízás kialakulása során a zsírszövetekben a makrofágok felhalmozódását szabályozzák.

Eredményeink azt mutatják, hogy a rezidens makrofágok felhalmozódnak az egerek zsírszövetében a sovány és a korai elhízás fázisában. Az ATM-ek fenotípusának elemzése az elhízás progressziója során feltárta, hogy a karcsú és a korai elhízás fázisában jelentős számú alternatív módon aktivált makrofág van jelen. Azonban a késői elhízás szakaszában ez a makrofágtípus drámai módon csökken. Érdekes módon beszámoltak arról, hogy az alternatív módon aktivált makrofágok növelik a lipid katabolizmus képességét. 24, 25, 26 Ezért az elhízás korai szakaszában alternatív módon aktivált makrofágok a fő rezidens makrofág populáció, amely speciálisabb lipid katabolizmussal rendelkezik, mint a bevándorló makrofágok.

Összefoglalva megállapítani tudtuk, hogy az elhízás során a zsírszövetekben a makrofágok felhalmozódását a rezidens ATM-ek in situ proliferációja váltja ki, és tovább segíti a monocita vándorlás és a makrofág proliferáció összehangolt aktiválása. Megfigyeléseink betekintést nyújtanak az elhízással járó gyulladás alakulására, és útmutatásul szolgálhatnak az elhízással járó rendellenességek terápiás stratégiáinak kidolgozásához.

Anyagok és metódusok

Állatkísérletek

A C57BL/6 egereket a Kínai Tudományos Akadémia Sanghaji Laboratóriumi Állatközpontjából (Sanghaj, Kína) vásároltuk. A C57BL/6 hátterű CD45.1 egereket dr. Yanyun Zhang a Kínai Tudományos Akadémia Egészségtudományi Intézetétől. A C57BL/6 háttérrel rendelkező heptozigóta egereket a Leptin receptor hiány (Lepr db/+) heterozigóta egerekből a Nanjing Egyetem (Nanjing, Kína) Állatkísérleti Központjától vásároltuk és laboratóriumunkban tenyésztettük. A STAT6 -/- (C.129S2-Stat6 tm1Gru/J) egerek a Jackson Laboratory-ból származnak (Bar Harbor, ME, USA). Az összes kísérletet a Kínai Tudományos Akadémia Sanghaji Biológiai Tudományok Intézetének Egészségtudományi Intézetének Intézményi Állatgondozási és Felhasználási Bizottsága hagyta jóvá.

A diéta okozta elhízást 5 hetes egerek 60 kcal% zsírtartalmú HFD-vel történő etetésével hajtottuk végre (D12492, Research Diets, New Brunswick, NJ, USA). A kontroll csoportot ND-vel tápláltuk. Az EdU beépítési tesztet a Click-iT-EdU tesztkészlettel (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) végeztük a gyártó utasításainak megfelelően. Az egereknek 10 µm-t adtunk 3 órával az elejtés előtt. g EdU/g testtömeg injekció formájában. A Click-iT reakciót zsírszöveten hajtottuk végre, és áramlási citometriával és immunhisztológiával elemeztük. Annak meghatározásához, hogy a rezidens makrofágok milyen mértékben járulnak hozzá az ATM-ek felhalmozódásához, az érzéstelenített CD45.2 egerek alsó hasát 6 cm vastag ólomtömbdel árnyékoltuk. Ezeknek az egereknek 9,5 Gy & ggr; kitettük és iv-be injektáltuk 107 CD45.1 csontvelő sejtet. A kiméra egereket a diétás kezelés előtt 7 hétig hagytuk helyreállításra. Az IL-4 ATM proliferációban betöltött szerepének vizsgálatához minden egérnek 5 ug kombinációt adtak. g IL-4 (Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA) és 25 ug. g IL-4 antitestet (11B11 klón, Harlan) injektált ip biotermékek Science, Indianapolis, IN, USA) vagy PBS és ATM elemzésre 48 órával később.

Áramlási citometria

Az eAT-t és az iAT-ot leölt állatoktól gyűjtöttük össze, apró darabokra vágtuk és 1,5 órán át PBS-sel öblítettük 1,5 mg 2 mg/ml I-es kollagénázzal (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). A lebegő zsírsejteket elválasztottuk a sejt-szuszpenzió centrifugálásával 600 x g-vel 10 percig. A raklapokat újraszuszpendáltuk, 70 µm-es szitákon átszűrtük és vörösvértesteket lizáltunk. A sejtszuszpenziót előzetesen inkubáltuk anti-CD16/CD32-gyel (eBioscience, San Diego, CA, USA) annak érdekében, hogy blokkoljuk az Fc receptorokat a felszíni molekula festése előtt. Az intracelluláris festést fixáló és permeabilizáló készletek alkalmazásával hajtottuk végre a gyártó utasításai szerint (eBioscience). Patkány monoklonális antitestek, köztük F4/80, CD45, CD11b, CD45.1, CD45.2, Ki67 és TNF-a az eBioscience-ből származnak; A CD115 és a Siglec-F a Biolegend-től (San Diego, Kalifornia, USA) származott.

A RELM- & agr; és TNF-? Az ATM-ekben 1: 1000 GolgiPlug-ot (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) adtak a kollagenázhoz a szövetek emésztése során. A felületi molekula festését követően intracelluláris festést hajtottunk végre fixációs készlet és permeabilizáló készlet alkalmazásával a gyártó utasításai szerint (eBioscience). Nyúl anti-RELM-α-t (Abcam, Cambridge, MA, USA) és Alexa Fluor 488 konjugált kecske anti-nyúl IgG-t (Life Technologies) használtunk.

Immunhisztokémia

A zsírszövetet apró darabokra vágtuk, és 4% paraformaldehiddel rögzítettük 24 órán át 4 ° C-on. Ezután teljes festést hajtottunk végre. Röviden, a mintákat 1% Triton X-100-mal permeabilizáltuk, 1% BSA-val és 3% FBS-sel blokkoltuk PBS-ben, majd a felszíni vagy a magmolekulákkal szembeni megfelelő antitestekkel inkubáltuk. Egyes kísérletek során az adipocitákat BODIPY 558/568 C12 (Invitrogen) ellenfestéssel láttuk el.

Statisztikai analízis

Az adatokat átlag ± SEM formában mutatjuk be, és a szignifikanciát párosítatlan kétfarkú t-próbával értékeltük, hacsak másképp nem jelezzük. Megnéztük a P ATM-et