A kutya dermális fibroblasztjainak replikatív öregedésének vizsgálata a
A Lipcsei Egyetem Állatorvosi Orvostudományi Kar Állatorvosi Anatómiai Intézetétől A kutya dermális fibroblasztjainak replikatív öregedésének vizsgálata az öregedési kutatáshoz való hozzájárulásként Doktori disszertáció a Doctor medicinae veterinariae (Dr. med.vet.) Fokozat megszerzéséhez A Lipcsei Egyetem Állatorvosi Karán benyújtotta Susanne Streit, Halle/Saale Lipcse, 2006
A lipcsei egyetem állatorvosi karának jóváhagyásával dékán: Prof. Dr. Karsten Fehlhaber Témavezető: Prof. Dr. med. állatorvos. habil. Franz-Viktor Salomon lektor: 1. Prof. Dr. med. állatorvos. habil. Franz-Viktor Salomon Állatorvosi Anatómiai Intézet, Lipcsei Egyetem Állatorvostudományi Kar 2. Dr. rer. nat. habil. Ulf Anderegg Kísérleti Dermatológiai Tanszék Egyetemi Bőrklinika Lipcsei Egyetem Lipcse 3. Prof. Dr. Dr. h.c. Wilfried Kraft I. Orvosi Állatorvosi Klinika, Állatorvos-tanszék, Ludwig Maximilians Egyetem, München Védelmi Nap: 2005. december 19.
Tartalom 1 Bevezetés 1 2 Irodalmi áttekintés 3 2.1 Öregedés 3 2.1.1 Az öregedés fogalmának meghatározása 3 2.1.3 Átlagos és maximális várható élettartam 4 2.1.4 Különböző fajok öregedése 4 2.1.5 A kutyafajok várható élettartama (Canis familiaris) 6 2.1.6 Az öregedés hatása a kutyafajokra 9 2.2 Öregedési kutatások 11 2.2.1 Öregedési elméletek 11 2.2.2 Az öregedés szintjei HAYFLICK (1985) szerint 12 2.2.2.1 Szervelméletek 12 2.2.2.2 Fiziológiai elméletek 12 2.2.2.3 Genom alapú elméletek 13 2.2.3 Sejtes öregedés 14 2.2.4 A fibroblasztok alkalmazása in vitro kísérletekhez 17 2.2.5 A fibroblasztok in vitro viselkedése, valamint a faj maximális és átlagos élettartamához, a donor életkorához és a donor egészségi állapotához való viszony 17 2.2.6 A replikatív paramétereinek meghatározása Szenszcencia 20 2.2.7 Kutyák az öregedéskutatásban 21 2.2.8 Az élettartam meghosszabbítása 22 3 Állatok, anyagok, módszerek 24 3.1 Kísérleti állatok 24 3.2 Materia zálogjog 25 3.2.1 Felhasznált vegyszerek 25 3.2.2 Pufferek és oldatok 26 3.3 Módszerek 27 3.3.1 Sejtkultúra 27 3.3.1.1 A minta anyaga 27 3.3.1.1.1 A mintagyűjtés 27 3.3.1.1.2 A minta előkészítése 27
3.3.1.2 Sejttenyésztés 28 3.3.1.2.1 Tenyésztési feltételek 28 3.3.1.2.2 Táptalaj-váltás 28 3.3.1.2.3 Szubkultiválás 28 3.3.1.2.4 Sejtszámolás és tripánkék festés 29 3.3.1.2.5 A sejtek fagyasztása 29 3.3.1.2. 6 A sejtek felolvasztása 29 3.3.1.2.7 Növekedési görbék létrehozása 30 3.3.2 Citológiai és immunocitokémiai vizsgálatok 30 3.3.2.1 Azan festés Heidenhain szerint 30 3.3.2.2 Giemsa festés 31 3.3.2.3 Mycoplasma kimutatása fluoreszcencia analízissel 31 3.3.2.4 Immunhisztokémia 32 3.3. 3 Fényképészeti dokumentáció 33 3.3.3.1 Az élő sejtek fényképezése 33 3.3.3.2 Az elkészített sejtfoltok fényképezése 34 3.3.3.3 A fényképezett sejtek mérése 34 3.3.3.4 Statisztikai elemzés és diagramok 34 3.4 A sejttenyészet paramétereinek kiszámítása 34 4 Eredmények 36 4.1 Előzetes vizsgálatok 36 4.2 A sejtek morfológiája tenyésztett sejtek 37 4.3 Fluoreszcencia elemzés 41 4.4 Immunhisztokémia 42 4.5 A tenyésztett sejtek proliferációs paraméterei 43 4.5.1 Összes sejtszám és vitalitás d sejttenyészetek 43 4.5.2 A szaporodás beállítása 46 4.5.3 Növekedési görbék 48 5 Megbeszélés 55 5.1 A módszertan kritikája 55 5.1.1 A kísérleti állatok kiválasztása 55 5.1.2 A kísérlet végrehajtása 57 5.2 A tenyésztési rendszerek értelmessége általában és különösen 60
6 Összegzés 72 7 Összegzés 74 8 Irodalomjegyzék 76
Az alkalmazott rövidítések listája ABC komplex BSA CPDL DAB DAPI DMEM DMSO DNS EDTA et al. FBS GSF HPDL IVL PBS PCR PDL PFA RNS TBS Tris Tris-HCl CNS Streptavidin-Biotin Complex Streptavidin-Biotin Complex kumulatív populáció megduplázza a 3,3'-Diaminobenzidin-Tetrahidroklorid 4 ', 6-Diamidin-2'Fenindindul-Dihidroklorid Módosított Eagle Közepes dimetil-szulfoxid-dezoxiribonukleinsav, dezoxiribonukleinsav-etilén-diamin-tetraecetsav és mtsai, valamint más, a Helmholtz Szövetség Környezetvédelmi és Egészségügyi Magzati Szarvasmarhaszérum Kutatóközpontja Láncreakció Populáció Kétszeres szint Paraformaldehid ribonukleinsav, ribonukleinsav Tris pufferolt sóoldat, Tris pufferolt fiziológiás sóoldat Tris (hidroxi-metil) aminometán Tris-hidroklorid normál kecskeszérum
A fibroblasztok problematikus előállítása, ezen sejtek alacsony tenyésztési igénye és nagy osztódási potenciálja jelentős előnyt jelent más sejttípusokkal szemben (PEACOCKE és mtsai 1991, SMITH és mtsai 1984). Jelen munka célja egy állat életkora és sejtjeinek (bőrfibroblasztok) proliferatív viselkedése közötti lehetséges összefüggések vizsgálata (a Beagle kutyafajtán belül). Erre a célra különböző korú kutya dermális fibroblasztok primer és szekunder sejttenyészeteit hozták létre. Az olyan paraméterek, mint a populáció megkettőzési szintje (PDL), a kumulatív populáció-megkettőzési szint (CPDL), a legmagasabb populáció-megkettőzési szint (HPDL), a generációs idő és az in vitro élettartam (IVL), leírják a tenyésztett sejtek replikációs potenciálját. Ezen paraméterek felhasználásával összehasonlítottuk a fiatal, felnőtt és idős állatok sejttenyészeteit. E munka eredményei a kutyák sejtes öregedésének további kutatásának lehetséges alapját jelentik in vitro modellek segítségével