A másodlagos növényi anyag izotiocianát - GRIN baktériumölő hatása

Műszaki munka (iskola), 2012

36 oldal, évfolyam: 1.0

Johannes Rößler (Szerző)

Tartalomjegyzék

2. Elméleti alapok
2.1. A glükozidok természetes előfordulása
2.2 Az izotiocianát jelentősége a növény számára
2.3 Kémiai elvek
2.3.1 Glükozidok
2.3.2 Sinigrin
2.3.3 Izotiocianát
2.4 Enzimatikus átalakítás
2.5 A szemináriumi cikk célja

3. Kísérleti megvalósítás és magyarázat
3.1 Az alkalmazott vizsgálati utasítások
3.2. Kivonatok
3.2.1 Sinigrin extrakció
3.2.2 Myrosinase extrakció
3.3. A glükozid-extraktum enzimatikus hidrolízise izotiocianáttá
3,4 vékonyréteg-kromatográfia
3.4.1 A vékonyréteg-kromatográfiai módszer magyarázata
3.4.2 Sinigrin vékonyréteg-kromatográfia elvégzése
3.4.3. Vékonyréteg-kromatográfia elvégzése izotiocianáton
3.4.4. Vékonyréteg-kromatográfia elvégzése izotiocianáton és szinigrinen
3,5 enzim teszt
3.5.1 Az enzimvizsgálat elvégzése
3.5.2 Az enzim teszt vékonyréteg-kromatográfiájának elvégzése
3.5.3 Az enzim teszt magyarázata
3.6 Antibakteriális kimutatási módszerek
3.6.1. Gátlási teszt az izotiocianát antibakteriális hatásának kimutatására
3.6.2 Bioautográfia

4. Eredmények
4.1. Vékonyréteg-kromatográfia eredményei
4.1.1 A Sinigrin vékonyréteg-kromatográfia eredményei
4.1.2. Az izotiocianát vékonyréteg-kromatográfiájának eredményei
4.1.3. Izotiocianát és szinigrin vékonyréteg-kromatográfiájának eredményei
4.1.4 Az enzimvizsgálat vékonyréteg-kromatográfiás eredményei
4.1.5 Az Rf értékek a relatív futási távolságot képviselik a DC-ben
4.2 Az antibakteriális kimutatási módszerek eredményei
4.2.1 A gátlási teszt eredménye
4.2.2 A bioautográfia eredménye

7. Függelék
7.1 Rövidítések listája
7.2. Táblázatok

1. Bemutatkozás

2. Elméleti alapok

2.1. A glükozidok természetes előfordulása

A glükozidok aminosavakból képződnek a növények másodlagos metabolizmusában (Watzl, 2001). Az aminosavakat aldoximra bontják, amelyet fenilecetsavvá, majd glükoziddá dekarboxileznek (Kindl, 1975). A glükozidok természetesen csak egy magasabb nemzetségű növényekben fordulnak elő (Dörnemann, 2008), például a keresztesvirágúak családjában (Brassicaceae, szinonima. Cruciferae; Ahlheim, 1983), mint a nemzetség legfontosabb képviselője (Luciano, 2009). Glükozidok azonban megtalálhatók a kapribogyóban (Capparidaceae), a nasturtiumban (Tropaeolaceae) és a Reseda növényekben (Rescedaceae) is (Dörnemann, 2008). Jelenleg összesen körülbelül 130 különféle glükozid ismert (Wittstock, 2004). A glükozidok szárazanyag-tartalma egyes Brassica fajokban akár 1% is lehet (Watzl, 2001), de a vad formában lévő glükozidok mennyisége 1000-szeresével meghaladhatja a termesztett növényben található mennyiséget (Watzl, 2001).

A mustárolaj-glükozidok a mustárnövényekben (Sinapis) találhatók, amelyek szintén a keresztesvirágúak családjába tartoznak (Ahlheim, 1983; Dörnemann, 2008). Ugyanakkor a különféle mustárok különböző mustárolaj-glükozidok keverékét képezik (Lara-Lledó, 2012). A fehér mustár (Sinapis alba) főleg szinapint, míg a fekete mustár (Brassica nigra) és a keleti mustár (Brassica juncea) főként sinigrint termel (Lara-Lledó, 2012). Általában az éles szag megjelenése a növény sejtszövetének megsemmisítése után jelezheti a mustárolaj-glükozidok jelenlétét (Dörnemann, 2008). Ezt a csípős szagot a mustárolajok (izotiocianátok) okozzák, ezek a mustárolaj-glükozid enzimatikus lebontásából származnak.

A mustárolaj-glükozid hidrolízisét végző enzimet mirozináznak vagy β-tioglikozidáznak nevezik (Lara-Lledó, 2012; Luciano, 2009; Watzl, 2001; Dörnemann, 2008). Minden mustárolajat termelő növényben előfordul.

2.2 Az izotiocianát jelentősége a növény számára

A mustárolaj-glükozidok enzimatikus lebomlásának termékei rendkívül hatékony védelmi anyagokat biztosítanak a növénynek a ragadozók (növényevők) és a növényi patogén mikroorganizmusok ellen (Wittstock, 2004; Aires, 2009). Ezek a termékek különféle izotiocianátok (ITC), tiocianátok és nitrilek, amelyek rendkívül mérgezőek a mikrobiológiai szervezetekre (Lara-Lledó, 2012; Watzl, 2001; Wittstock, 2004; Luciano, 2009). Az izotiocianát önmagában baktericid, fungicid, herbicid és toxikus hatást gyakorol az állati szövetekre (Aires, 2009; Luciano, 2009; Lara-Lledó, 2012; Hock, 1984).

A növényi önvédelemnek ezt a formáját konstitutív védekezésnek nevezik, mivel a védőanyag előzetes szakasza a sejtekben alakult ki, mielőtt a növényevőkkel vagy a kórokozóval kapcsolatba került volna. A növényi toxin azonban csak akkor termelődik, ha a sejtszerkezet közvetlenül megsebesül. Ezt a folyamatot gyakran növényi mustárolaj "bombának" nevezik, mert csak akkor vált ki, amikor a két komponens közvetlen érintkezésbe kerül (Wittstock, 2004).

A mustárnövényben vagy a mustármagban a mustárolaj-glükozid és a mirozináz térben el vannak választva. Az enzim szubsztrát (mustárolaj-glükozid) a sejtfal közelében lévő rekeszekben (vakuolákban) helyezkedik el (Rausch, 1999), míg az enzim (mirozináz) az úgynevezett indoblasztokban (specializált sejtek/a sejtstruktúra "furcsai") oszlik el (Sitte, 1998) . Az enzim és szubsztrátja mechanikus hatással érintkezik, ezt követően a reakció megindul, és a védekező toxin kibontja hatását (Dörnemann, 2008; Lara-Lledó, 2012; Watzl, 2001). Más, glükozidokat tartalmazó növényi nemzetségek azonban különböző módon tárolják a szubsztrátumot és az enzimet. A tallkresz (Arabidopsis thaliana) például úgynevezett glükozidtartalmú S-sejteket képez a szita közelében, valamint saját mirozinázsejtjeit a kérgén (Wittstock, 2004).

2.3 Kémiai elvek

2.3.1 Glükozidok

A glükozidok (glükozinolátok) (1. ábra) kémiailag stabil, nem illékony, ionos biomolekulák, amelyek a kéntartalmú metabolitok csoportjába tartoznak. Ezek egy kén-nitrogént tartalmazó csoport glükózegységéből, egy szulfátcsoportból és egy változó maradékból állnak. A szerkezet tehát egy N-hidroxi-imino-szulfát-észteren lévő tioglikóz-maradék és az aglukon-maradék kombinációja (R, lásd alább). Ez a gyök alkil-, alkenil-, aril- vagy indolilcsoportból állhat. Meghatározza a fiziológiai hatást (Watzl, 2001; Wittstock, 2004). A szulfátcsoporton van kation, általában K + (Dörnemann, 2008).

Az ábra nem szerepel ebben a kivonatban

1. ábra: A mustárolaj-glükozid általános szerkezete

A glükozidok nómenklatúrája más, ezért a köznév kialakulásakor a növény nevét „Gluco” előzi meg, és az „in” végződéssel egészül ki. Például a vízitorma glükozidját (Nasturtium officinale) "Gluco-nasturti-in" néven emlegetik (Dörnemann, 2008). A szisztematikus név azonban pontosabb, amint azt a 2. ábra mutatja.

Az ábra nem szerepel ebben a kivonatban

2. ábra: Nómenklatúra példája vízitorma

2.3.2 Sinigrin

A szinigrin szisztematikus neve allil-glükozinolát, vegyi anyag 1- (N- (szulfoxi)-

3-butenimidát-1-tio-β-D-glükopiranóz. Az empirikus képlet:

[C10H16NO9S2] -K +. A molekulatömeg 397,46 g/mol (Sigma-Aldrich). A 3. ábra a sinigrin szerkezetét mutatja.

3. ábra: A sinigrin molekuláris szerkezete

Az ábra nem szerepel ebben a kivonatban

2.3.3 Izotiocianát

Az izotiocianátokat a „mustárolajok” kifejezés alatt foglaljuk össze. Az izotiocianátok illékony és kémiailag instabil molekulák, ha indoil-glükozinolátokból képződnek. Spontán bomlanak indol-3-karbinollá és más indolvegyületekké (Watzl, 2001). A mustárolaj-glükozid enzimatikus lebontásából származnak, és mérgező hatásúak. Az alapszerkezet a következő (4. ábra):

Az ábra nem szerepel ebben a kivonatban

4. ábra: Az ITC általános molekuláris szerkezete

Az allil-glükozinolát átalakulásakor az allil-izotiocianát (AITC) képződik (Aires, 2009). Ennek empirikus képlete a C4H5NS (szerkezeti képlet lásd az 5. ábrát). A molekulatömeg 99,15 g/mol (Sigma-Aldrich).

Az ábra nem szerepel ebben a kivonatban

5. ábra: Az AITC molekuláris szerkezete

2.4 Enzimatikus átalakítás

A mustárolaj-glükozid mustárolajsá történő hidrolízisét a mirozináz katalizálja, ezáltal a szubsztrát (mustárolaj-glükozid) kén-glükóz kötése hidrolizálódik (Wittstock, 2004). Ekvimoláris mennyiségű p-D-glükóz, szulfát és glükozid-specifikus aglukon képződik. Az aszkorbinsav koenzimként működik itt, mivel nukleofil katalitikus csoportot képezhet. Az instabil aglukon a pH-érték és a hőmérséklet függvényében tovább reagál az elsődleges termékre, az izotiocianátra (Wittstock, 2004). Másodlagos termékek, például tiocianátok, nitrilek és epitionitrilek is képződnek (Lara-Lledó, 2012). Az izotiocianátok főként semleges pH-értéken, míg a nitrilek savas pH-értéken képződnek (Wittstock, 2004). A 6. ábra az enzimatikus átalakítási folyamat áttekintését mutatja.

Az ábra nem szerepel ebben a kivonatban

6. ábra: A glükozidok enzimatikus átalakulásának mechanizmusa és termékei

2.5 A szemináriumi cikk célja

E munka célja a mustármag-glükozid sinigrin és a myrosinase enzim kivonása a mustármagokból. Az enzimnek hidrolizálnia kell a glükozidot izotiocianáttá (ITC). Ezenkívül meg kell erősíteni az enzimatikus reakciótermék antibakteriális hatását és azonosítani kell az ITC-t a reakció anyagkeverékében.

Ennek a munkának az volt a célja, hogy először meghatározzuk, hogy a bioautográfiai módszer egyszerűsített változata (Reusser, 1967) alkalmas-e az izotiocianát elválasztására az extrakciós reakció (vékonyréteg-kromatográfia) reakcióelegyből és a baktériumokra gyakorolt mérgező hatása révén.

A kísérleteket Brassica juncea magjaival végeztük, mivel a Develey GmbH információi szerint ezek több mustárolaj-glükozidot tartalmaznak, mint a kísérleti utasításokban leírt Sinapis alba magjai (Dörnemann, 2008).

3. Kísérleti megvalósítás és magyarázat

3.1 Az alkalmazott vizsgálati utasítások

A myrosinase és sinigrin extrakciójára vonatkozó vizsgálati utasítások, a vékonyréteg-kromatográfia (TLC) enzimatikus átalakításának és megvalósításának protokollja többnyire a tanfolyam utasításai: "Másodlagos növényi összetevők", PD Dr. Dieter Dörnemann, a Marburgi Philipps Egyetem biológiai (növényfiziológiai/fotobiológiai) tanszékéből vették (Dörnemann, 2008).

Az egyes alfolyamatokat azonban egymástól függetlenül változtatták meg. A sinigrin és a mirozináz kivonására a Brassica juncea fajta mustárját használták, mivel ennek a fajtának van a legnagyobb sinigrin tartalma, és így az irodalom szerint a legerősebb antibakteriális hatást mutatja (Lara-Lledó, 2012).

A bakteriális gátlási tesztre vonatkozó utasításokat a "Mikrobiologisches Praktikum" könyvből (Drews, 1983) vettük át. A bioautográfia módszertanát a következőképpen módosították: "Módszer vékonyréteg-kromatogramok bioautográfiájához" (Reusser, 1967).

3.2. Kivonatok

3.2.1 Sinigrin extrakció

A szinigrin tisztítási eljárása 10 g mustármag magjának egy mozsárban történő őrlésével kezdődött, 30 ml 80% -os vizes etanol hozzáadásával. Ez tönkretette a sejtek szerkezetét és felszabadította a glükozidot. Az alkohol megakadályozta a sinigrin mirozináz általi enzimatikus átalakulását. A homogén masszát ezután egynyakú lombikba helyeztük, és 80% -os etanollal (vizes oldat) 100 ml-re töltöttük. A terméket 60 percig forraljuk visszafolyató hűtő alkalmazásával (7. ábra), vízfürdőben melegítjük és az etanol/víz elegy miatt a forráspont kb. 85 ° C.

Az ábra nem szerepel ebben a kivonatban

7. Ábra: Sinigrin extrakció a 8. Ábrán: A

Vízfürdő reflux kondenzátorral 1. Sinigrin extrakció

Ennek eredményeként a szinigrin a keverék etanol-víz fázisában kötött. A kapott vizes etanol felülúszót eltávolítottuk (1. extrakció, 8. ábra). Ezzel a módszerrel a maradékot ismét 50 ml 80% -os vizes etanollal elegyítjük. Ezúttal csak 30 percig forraljuk visszafolyató hűtő alkalmazásával. Ez a 2. extrakció növeli a sinigrin hozamát. A két extrakció felülúszóit egyesítettük és centrifugáltuk, hogy a szilárd anyagot teljesen elválasszuk, és a felülúszót ismét kivettük további feldolgozás céljából. Rotációs bepárlóban (9. és 10. ábra) az összes etanolt vákuumban eltávolítottuk, és a szinigrint vizes fázisban betöményítettük (11. ábra).

Az ábra nem szerepel ebben a kivonatban

10. ábra: Koncentrálás előtt

Az ábra nem szerepel ebben a kivonatban

9. ábra: Rotációs párologtató 11. ábra: Koncentrálás után

Ezt követően az elegyet először 10 ml-re hígítottuk vízzel (dd) erős fehér-sárgás csapadékkal. Ezután H2O-val (dd) 30 ml-re töltjük. Ezután többször dietil-éterrel extraháltuk, amelynek eredményeként a hidrofób komponensek (például sejtes lipidek) átmentek az éterfázisba, és az alsó fázis felemelésével és újrafelhasználásával eltávolították az extraktumból. A fent említett fehér csapadék éteres extrakcióval eltávolítható. A szinigrint tartalmazó vizes fázist ezután rotációs bepárlóban 5 ml-re bepároljuk a szinigrin koncentrálása céljából. A bepárlás mellékhatása a maradék dietil-éter teljes eltávolítása. A kapott készítményt 4 × 200 μl-es részekre osztottuk és -20 ° C-on lefagyasztottuk, vagy vékonyréteg-kromatográfiának és enzimatikus átalakításnak vetettük alá.

3.2.2 Myrosinase extrakció

Annak gátlására, hogy a sejtproteázok lebonthassák az extrahálandó mirozináz enzimet, az összes tisztítási lépést hűtött módon hajtották végre, így a habarcsot, mozsarat és evőeszközöket a kísérlet előtt N2-vel hígították. Most 20 g mustármagot (12. ábra) felőröltünk, felszabadítva az enzimet a sejtekből.

Az ábra nem szerepel ebben a kivonatban

12. ábra: Süllyesztõ 13. ábra: Dekantálás 14. ábra: Dialízis csõ

3.3. A glükozid-extraktum enzimatikus hidrolízise izotiocianáttá

Cím A másodlagos növényi anyag izotiocianát (mustárolaj) baktériumölő hatása 1. évfolyam Szerző Johannes Rößler (Szerző) Év 2012 Oldalak 36 Katalógusszám V300661 ISBN (e-könyv) 9783656966845 ISBN (könyv) 9783656966852 Fájlméret 1824 KB Nyelv Német Megjegyzések A Műszaki 10. hallgatói konferencia 1. díja Müncheni Egyetem, együttműködés a müncheni Helmholtz Központtal, a Develey GmbH támogatásával. Kulcsszavak Gymnasium Grafing, Müncheni Műszaki Egyetem, Helmholtz Zentrum München, TUM hallgatói konferencia, mustár, mustárolaj-glükozid, izotiocianát, bioautográfia, mirozináz, baktericid hatás, Sinapis juncea, vékonyréteg-kromatográfia, baktériumok gátlási tesztje, kémia, biokémia, szemináriumi cikk Ár (könyv) € 14,99 (e-könyv) 12,99 € mű, idézve Johannes Rößler (szerző), 2012, a másodlagos növényi anyag izotiocianát (mustárolaj) baktericid hatása, München, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/300661

Még nincsenek hozzászólások.