A szubkután angiotenzin II infúzió ozmotikus szivattyúkkal aorta aneurizmákat indukál az egerek protokolljában

Összegzés

Az ozmotikus szivattyúk szubkután beültetése kényelmes megközelítést kínál a hosszabb és következetesebb csatlakozáshoz. Ezt a megközelítést széles körben alkalmazták mind a hasi, mind a mellkasi aorta aneurysmáinak vizsgálatára egerekben.

Bevezetés

Az aorta aneurizmák az aorta tartós lumenmegnagyobbodását mutatják, ami szakadásra utal és általában halálhoz vezet. Ez a betegség mind a hasi, mind a mellkasi aorta régiókban fordul elő, amelyeket hasi aorta aneurizmának (AAA), illetve mellkasi aorta aneurizmának (TAA) neveznek. A molekuláris mechanizmusok és a kórélettani folyamatok hiányos megértése miatt nincs olyan bizonyított orvosi terápia, amely megakadályozhatja az aorta aneurysma mindkét típusának kiterjedését vagy felszakadását. Mivel nehéz betegmintákat gyűjteni és közvetlenül emberen kísérleteket végezni, az AAAS mechanizmusainak meghatározására összpontosító kutatást gyakran állati modellekből extrapolálták. Általánosan alkalmazott állatmodell az angiotenzin II (AngII) szubkután infúziója egerekbe. Összehasonlítva az egerekben az AAA-k kiváltásának egyéb sebészeti megközelítéseivel, például az aortán belüli elasztáz perfúzióval vagy a kalcium-klorid peri-aorta alkalmazásával, amelyekhez 1,2 laparotómiát igényelnek, ez a módszer nem igényli a testüregbe való bejutást és minimális sebészeti készséget igényel 3,4.

Egerekben az AngII infúzió a mellkasi aorta régió mély kiterjedését eredményezi, amely többnyire az emelkedő aortára korlátozódik, amely a TAA-k leggyakoribb régiója az embereknél 19, 22–26. Az AngII-indukálta AAA-khoz hasonlóan az AngII-infúzió során indukált TAA-k is összefoglalják az emberi TAA-k 25 számos funkcióját. Az AngII-indukált AAA-kkal ellentétben azonban az AngII-indukált TAA-k nem társulnak hiperkoleszterinémiával és nem rendelkeznek nemi különbségekkel.

Az egerek szubkután AngII infúziójának általános célja az AAAS és a TAA kóros jellemzőinek és molekuláris mechanizmusainak tanulmányozása.

Jegyzőkönyv

Etikai nyilatkozat: Az egérvizsgálatokat a Kentuckyi Egyetem Állattenyésztési és Felhasználási Bizottságának engedélyével végzik (IACUC protokollszám: 2006-0009). Fektetés után az egereknek túladagolnak egy ketamin-koktélt (

1. Az AngII összeg kiszámítása

Megjegyzés: Ez a protokoll az Infusion AngII (1000 ng/kg/perc) példáján alapszik, telített zsírsavval dúsított étrendet táplálva 4 hétig 4 hím LDL receptor -/- egérben.

  1. Mérje le a vizsgálati egereket, mielőtt kiszámítja az infúzióhoz szükséges AngII mennyiségét.
  2. Használja a sablont (Asztal 1) a kísérlethez szükséges AngII tömeg kiszámítása. Használja a szivattyúk használati utasításában szereplő "Mean Pumprate" értéket a sablon 4. lépésében bemutatott "Pumprate" néven. A sablonrekordban az 1-5. Lépéseket manuálisan, a 6-10. Lépéseket pedig automatikusan kiszámítja.
    1. Arra hivatkozva, hogy az egerek 1 g testtömeget kapnak 1000 ng AngII/kg/perc infúzió alatt 4 héten keresztül.
      MEGJEGYZÉS: Minden egérnek nagyon eltérő a testtömeg-növekedése, amely sok változótól függ, például az egér törzsétől és a diétától. A korábbi tanulmányok saját tapasztalatai alapján rutinszerűen használjuk a "0" vagy "1 g" értéket.
    2. Számítson ki 300 μl teljes térfogatú AngII oldatot minden egér esetében, mivel minden pumpához hozzávetőlegesen 250 μl szükséges.

2. Az Ang feloszlatása

  1. A liofilizált AngII injekciós üvegeket -20 ° C-on tárolja. A kinyitás előtt az AngII injekciós üvegeket szobahőmérsékletre kell egyensúlyozni.
  2. Mérjük meg a számított AngII tömeget (7,3 mg, mint a 1. táblázat látható) steril műanyag csőben.
    MEGJEGYZÉS: A Merck Index szerint ne használjon üvegcsöveket oldáshoz, mert az AngII vizes oldata erős affinitással rendelkezik az üveghez való kötődéshez.
  3. Adja hozzá a számított steril sóoldat térfogatát (1200 μl) a liofilizált AngII-t tartalmazó kupakot tartalmazó műanyag csőbe, és fordítva keverje addig, amíg az oldat tiszta nem lesz.
  4. Az egyes steril műanyag csöveken (0,5-1,5 ml) jelölje az 1., 2., 3. és 4. egér számát. Készítsen AngII oldatot lamináris burkolat alatt minden egér számára a testsúly alapján, az 1.2 lépés szerint és Az 1. táblázat kiszámítva.
    1. Például pipettázzon 3,6 μl steril sóoldatot az 1. csőbe, majd 296,4 μl AngII oldatot, és óvatosan fel és le pipettázással keverje össze.
  5. Címkékkel ellátott egerek számát kupakokkal ellátott műanyag csöveken (4 ml, steril). Ezeket a szivattyúk inkubálására használják a 3.13 lépésben leírtak szerint.

3. ozmotikus szivattyú feltöltése

7. Az arorták képalkotása

  1. Vágja át az aortát hosszanti irányban az aortaív külső és belső görbületén, és nyissa ki a fő ágakat, beleértve az innominált, a bal carotis artériát és a bal clavicularis artériát. Az aortát laposra kell helyezni, külső Adventi fektetéssel a fekete viasz mellett.
  2. Keresse meg az intim felület aortájának en arcképét ugyanolyan nagyítással. Mindegyik képbe illesszen egy vonalzót a kalibráláshoz, amint megjelenik ban ben a 4.

Reprezentatív eredmények

A protokollban leírt 4 hím LDL receptor -/- egeret 4 hét AngII infúzió után eutanizálták. Az aortákat összegyűjtöttük, megtisztítottuk és leképeztük az aorta dilatációinak szemléltetése céljából. Mint a A 3. ábra látható, az aorták különféle tulajdonságokkal rendelkeznek, beleértve a mellékvese régió tágulását (AAA-k; 3A), a mászási terület kiterjesztése (TAA-k; 3B) vagy mindkét terület kiterjesztése (mind az AAA, mind a TAA-k, Ábra 3C), míg az egerek morfológiája nagyjából normális volt (3D). A hasi aorta tágulását a mellékvese régió ex vivo maximális szélességének mérésével határozzuk meg, amelyet a piros vonal jelez ban ben 3A. Az aorta növekvő dilatációjának mérésére az aortákat kivágtuk és feljegyeztük, mint a A 4. ábra látható. Az intim felületen vörös vonalakat mértünk az emelkedő aorta területen (a th ban ben (4A. Ábra) a TAA-k számszerűsítésére. Azóta minden képhez tartozik egy vonalzó a mérések szabványosítása érdekében ban ben két ábra 3. és 4. ábra.

szubkután
. 1. ábra A töltött ozmotikus szivattyú reprezentatív képe Minden szivattyú két részből áll: egy fő testből és egy áramlásmérőből. Miután a szivattyútestet AngII-val feltöltötte, az áramlásszabályozót bevezetik a szivattyú lezárására.

infúzió
2. ábra A szivattyúimplantátum-műtét folyamata (A) Az egeret egy orr-kúppal ellátott lamináris burkolatba helyezzük, amely folyamatosan izofluránt és oxigént szabadít fel összehozták. (B) A bemetszésbe egyenes hemosztátot helyezünk be, hogy szubkután alagutat képezzünk; (C) A szivattyú kíméletes a behúzott bőrmetszésen keresztül; (D) A bőr bemetszését a szivattyú behelyezése után tűzzük meg.

infúzió
3. ábra AngII-val infundált egerek aorta képei (ex vivo) AngII 1000 ng/kg/perc infúziót adott a férfi LDL receptorhoz -./- egerek 28 nap. (A) AAA-k trombózis kíséretében; A piros vonal (2,05 mm) a mellékvese régióban a maximális aorta szélesség mérését mutatja. (B) emelkedő aorta dilatáció (TAA) nagyjából normális hasi aortával; (C) Mély dilatációk mind a felszálló, mind a mellékvese aorta régióiban (TAA és AAA); (D) durván normális aorta, anélkül, hogy a felemelkedő vagy a mellékvese aorta régió nyilvánvalóan megnagyobbodna.

4.jpg "/>4. ábra: AngII-val fertőzött egerek mellkasi aorta régióinak képei Az AngII-t 1000 ng/kg/perc-rel infundáltuk a férfi LDL-receptorokba infúzióban. -/- egerek 28 napig. A piros vonallal körvonalazott terület az emelkedő aorta régiót jelöli, beleértve az aortaív egy részét is.

1 Dózis szükséges 1000 ng/kg/perc
2 Indítsa el a testsúlyt (legnagyobb egér) 24.8 G
3 Becsült teljes testtömeg-növekedés 1 G
4 Szivattyúzási sebesség 0,25 ul/óra
5. Egerek száma 4
6. Adagolás óránként az állat számára 1518 ng
7. Koncepció szükséges 6072 ng/ul
8. 300 μl oldathoz 1.82 mg/300 µ
MEGOLDÁS SZÜKSÉGES
9. Összes AngII (mg) 7.3 mg
10. Sóoldatban oldva és # 160; 1200 ul
egér testsúly Hígítási tényező Kötet (ul) Szivattyú tömege (g) Töltött arány
# (G) AngII Sós Üres Megtöltött (%)
1 24.5 1.0 296.4 3.6 1.1443 1.3877 99
2 23.0 0.9 278.2 21.8 1.1677 1.4145 100
3 24.8 1.0 300,0 0,0 1.1438 1.3904 100
4 21.8 0.9 263.7 36.3 1.1438 1.3904 100
Hígítási tényező = egér testtömege/legnagyobb egér testtömege
egér testsúly Hígítási tényező Kötet (ul) Szivattyú tömege (g) Töltött arány
# (G) AngII Sós Üres Megtöltött (%)
1 24.5 1.0 296.4 3.6 1.1443 1.3877 99
2 23.0 0.9 278.2 21.8 1.1677 1.4145 100
3 24.8 1.0 300,0 0,0 1.1438 1.3904 100
4 21.8 0.9 263.7 36.3 1.1438 1.3904 100

1. táblázat: Számítás a 28 napos infúzióhoz ozmotikus pumpákkal.

Vita

Az AngII-t szubkután adagoló ozmotikus pumpák rutinszerű megközelítést jelentenek az aorta aneurysma indukciójában egerekben. Számos laboratórium adatai alapján folyamatos eredmények azt mutatták, hogy ez megbízható és reprodukálható módszer mind az AAA 3,4, mind a 22-26 TAA vizsgálatára egerekben. Ezért ezt az egérmodellt olyan modellként használják, amely összefoglalja az emberi aorta aneurysma számos funkcióját, és mechanisztikus betekintést nyújt ezekbe a pusztító betegségekbe.

Míg az öregedés az AAA kockázati tényezője az emberekben, egerekben nem szisztematikusan vizsgálták az AngII által kiváltott AAA-kat. Úgy tűnik azonban, hogy az AngII által kiváltott AAA-k incidenciája és súlyossága hasonló a 8-48 hetes 4,5,7 éves egereknél. Jelenleg csak néhány olyan tanulmány készült AngII által indukált TAA-ról 8–24 hetes, 22–26 hetes egereken, amelyek nem mutattak nyilvánvaló életkorral kapcsolatos különbségeket a TAA képződésében.

Összefoglalva, az AngII infúziót ozmotikus pumpákkal történő szubkután beültetéssel érjük el, hogy egerekben aorta aneurysmákat indukáljunk. Ez a módszer bizonyos időtartamokra folyamatosan, meghatározott sebességgel szállítja az AngII-t, amelyet mind az AAA-k, mind a TAA-k tanulmányozására használnak.

Közzétételek

A cikk megjelenését az Alzet szponzorálja.