A zsírraktár-specifikus Sca1 magas zsírszármazékú őssejtek (ASC) immunmágneses elválasztása
Bevezetés
Az elhízás és a cukorbetegség területén a szöveti fibrózis és a gyulladás kritikus szerepet játszik a 2-es típusú cukorbetegség 3 kialakulásában és fenntartásában. Nemrégiben Tokunaga et al. azt mutatta, hogy inguinalis izolált magas sejtekből Sca1 (vagy szubkután, SQ) és perigonadal (vagy visceralis, VIS) 10 különböző génaláírás és in vitro ECM átalakítás mutatta a C57BL6/J zsírlerakódást. Az MMP14 (MT1-MMP), a membrán típusú mátrix-metalloproteináz (MMP) család prototípusos tagja, a fehér zsírszövet (WAT) fejlődését közvetíti kollagenolitikus aktivitása révén 1.
A sejtekkel a következő protokoll szerint végrehajtható kísérletek közé tartozik a háromdimenziós tenyésztés, a differenciálódási vizsgálatok, a kollagén lebontási vizsgálatok és az izolált és dúsított 10,11 RNS-szekvenálás. A lebomlási vizsgálatokat savval extrahált kollagénnel kell végrehajtani a 11,12 telopeptid megőrzésének biztosítása érdekében. A következő protokoll bemutatja az elsődleges sejtek vaszkuláris sztrómájának különféle zsírlerakódásokból történő izolálásának és adipocita progenitor sejtekké történő dúsításának módszereit immunmágneses sejtszeparáció alkalmazásával. A sejtrendezés érvényessége áramlási citometriával és Sca1-GFP-egerek alkalmazásával értékelhető, amelyek Sca1 + sejtekben expresszálják a GFP-t, Sca1-promóter 13.
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.
Jegyzőkönyv
Etikai nyilatkozat: A Michigani Egyetem Állathasználati és Gondozási Bizottsága (UCUCA) minden módszert és protokollt jóváhagyott a laboratóriumi állatok gondozására és felhasználására vonatkozó útmutatónak megfelelően (Laboratóriumi Állatkutatási Intézet, Nemzeti Kutatási Tanács). Az egereket a Michigani Egyetem viváriumában helyezik el, ingyenes hozzáférést kapnak az ételhez és a vízhez, és 12 órás világos/sötét ciklusban tartják őket.
2. A szubkután (SQ) zsírpárnák izolálása
- Eutanizálja az egeret izoflurán és pneumothorax túladagolásával.
- Finoman permetezze az egeret 70% -os etanollal, és fektesse a hátára. A mancsokat 22 G tűvel rögzítse a hablemezhez.
- Vessen egy kis vágást a has bőrébe. A metszés hegyét a csipesszel tartva vegye meg az ollót és válassza le a bőrt, mielőtt elválasztaná a hashártyát.
- Miután a bőr elválik a hashártyától a hastól a mellkasig, a bőr a hashártyától a fej felé tükröződik a test oldala mentén a bőrön lévő oldalsó vágások révén.
- Tükrözze meg az ágyékban lévő megmaradt bőrt, tartsa távol a zsírt a testétől, és rögzítse a lemezt 22 G tűvel.
- Váltson finom ollóra és csipeszre. Fogja meg az inguinalis zsírpárnát a csipesszel az eredeténél a peritoneum közelében, és vágjon el a bőr és az inguinalis zsír között az ágyék felé, előrelépve, elkerülve, hogy az SQ szennyezze a bőrt.
- Helyezze a szigetelt ágyéki zsírpárnát a kijelölt 60 mm-es tálcába.
3. Visceralis (VIS) zsírpárnák izolálása
- A 2.5 lépéshez hasonló módon vágja fel a hashártyát, hogy jól láthatóvá váljon a zsigeri zsír.
- Mozgassa a beleket a mellkas felé.
- Fogja meg a VIS zsírpárnáját a disztális végén, és óvatosan húzza fel. Bontsa ki a VIS zsírpárnáját, miközben óvatosan zárja ki az epididymális (vagy a méh, ha nőstény egereket alkalmazzák) szöveteket.
- Helyezze a címketálcába, és ismételje meg a 3.3 lépést a fennmaradó VIS betétnél.
4. A zsírlerakódások kollagenázos emésztése
6. A Sca1 magas ACS-ek immunmágneses elválasztásának ellenőrzése áramlási citometriával
- A sejteket kétszer öblítsük le HBSS-sel (-Ca, -Mg), és disszociáljuk a sejteket 0,05% tripszinnel.
- Centrifugáljuk a sejteket 300 xg-n 5 percen keresztül. Szuszpendáljuk fel a sejteket 1 ml táptalajban, és számoljuk meg a számláló kamrát.
- Vegyünk> 106 sejtet 1 ml táptalajba, és centrifugáljuk 300 g-vel 5 percig.
- Távolítsa el a felülúszót, és ismételje meg még egyszer a 6.3. Lépést.
- A sejteket 1 ml 2% -os kecskeszérummal és 2% BSA-val kezeljük, és 30 percig szobahőmérsékleten blokkolunk.
- Centrifugáljuk a sejteket 300 xg sebességgel 5 percig.
- Távolítsa el a blokkolt oldatot.
- Adjunk hozzá 100 ug-ban patkány IgG2a Alexa Fluor 647-et (0,25 ug, 1: 400) vagy anti-Sca1 Alexa Fluor 647-et (0,25 ug, 1: 400). 1 PBS 2% kecskeszérummal és 2% BSA + PBS 4 ° C-on 30 percig sötétben.
- Adjon 1 ml hideg PBS-t a sejtekhez. Centrifugáljuk 300 xg-t 5 percig 4 ° C-on.
- Távolítsa el a felülúszót, és ismételje meg a 6.9. Lépést még kétszer.
- A sejtek 1 ml PBS-ben. Vezesse át a sejt szuszpenziókat 100 µl-en. m Sejtszita áramlási citometriás elemzés előkészítése céljából.
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.
Reprezentatív eredmények
Sca1 magas ASCS felhalmozódása különböző zsírpárnákból.
Az SQ zsírból izolált vaszkuláris stromális sejtek fibroblasztszerű, hosszúkás sejtformát mutatnak, a Sca1 expresszió szintjétől függetlenül (1A. Ábra). Másrészt a VIS (EWAT-eredetű) Sca1 high és Sca1 low sejtek markáns különbségeket mutatnak sejt alakjukban. Az SQ (iWAT-eredetű) Sca1 magas sejtekhez hasonlóan a VIS (EWAT-eredetű) Sca1 magas sejtek hosszúkás, fibroblasztszerű sejtformát mutatnak, míg a VIS Sca1 alacsony sejtek epithelioid alakot mutatnak. Az SCA1-GFP egerekből izolált SCA1 magas sejteket könnyen azonosíthatjuk GFP-pozitív sejtként a szövetkultúrában (1B) azonosított. Amikor ezeket a sejteket citometriás áramlás alkalmazásával értékeltük, a GFP-pozitív sejtek nagy része megerősítette, hogy a sejtfelületen expresszálják a Sca1 fehérjéket, amint azt Ti-Sca1 antitesttel kimutatták. (1C). Az inguinalis zsírpárnákból származó Sca1 magas sejtek fenntartják az adipociták kapacitását - növekszik a differenciálódás, míg az EWAT eredetű Sca1 magas sejteket nehezebb megkülönböztetni az adipocitákban található hagyományos 10 adipogén keverékkel.
A Sca1 High ASCS zsírraktártól függő gének expressziója (2. ábra).
Az RNS szekvenciával végzett genomszintű transzkriptóm elemzések kimutatták az extracelluláris mátrixfehérjék és módosítók (GO: 0.031.012, GO: 0005578) génjeinek gazdagodását ezekben a Sca1 magas ASCS 10-ben. Valós idejű PCR-elemzésekkel sikerült kimutatni a különböző Kollagenolitikus MMP-k (MMP-2, MMP8, MMP13, MMP14) expressziója az iWAT- és az EWAT-eredetű Sca1 között a magas ASCS-szint kimutatására. Amikor fluoreszcenciával jelölt I. típusú kollagén géleket használtunk o a pericelluláris degradációs aktivitás értékelésére, megfigyeltük a VIS Sca1 magas ASCS által közvetített, szignifikánsan megnövekedett kollagén remodelláló aktivitást 10.
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.
Vita
Itt mutatjuk be az egér ASCS különféle zsírpárnákból való izolálását és immunmágneses sejtek elválasztását, valamint felhasználásukat az in vitro kísérletekhez. A bemutatott módszer hatékony nagyszámú Sca1-pozitív ASCS gyors izolálására, ami előnyös az ASCS 9, 14 technikailag bonyolult és drága FACS által közvetített izolálásával szemben. A FACS-tól eltérően az immunmágneses sejtek szétválasztása nem teszi lehetővé több antigén alkalmazását a célsejtpopuláció azonosítására. Mindazonáltal, ha a felületi antigént jól jellemzik, az immunmágneses szétválasztás növeli a sejtek számát anélkül, hogy FACS eszközök 15 használatára támaszkodnának, amelyek még mindig nem állnak rendelkezésre kis intézetekben, ahol nincsenek alapvető létesítmények sok biológiai kutató elemzésére .
Noha a Sca1 nem található meg az emberi genomban, az alternatív sejtfelszíni antigének azonosítása és validálása a zsírraktártól függő emberi zsírszövet őssejteken 17-ig expresszálódott, ehhez a sejtszeparációs technikához társítva segíthet meghatározni az emberi zsírszövet őssejtjeinek biológiáját.
Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.
Közzétételek
A szerzőknek nincs mit elárulniuk.
Köszönetnyilvánítás
Ezt a munkát az NIH DK095137 (THC) támogatja. Köszönetet mondunk a jelenlegi és a volt laboratóriumi tagoknak, akik hozzájárultak a leírt eljárások kidolgozásához és finomításához.