Autoimmun betegségek szabályozása a PTPN CT polimorfizmus és az NCF1 gén keresztül
A Tübingeni Egyetem Hertie Klinikai Agykutató Intézetéből Általános Ideggyógyászati Tanszék megbízott orvosigazgató: Dr. A. Az autoimmun betegségek Melms-szabályozása a PTPN22 1858 * C/T polimorfizmus és az NCF1 gén/pszeudogénszerkezet alapdolgozatával a tübingeni Eberhard Karls Egyetem orvosi karának orvostudományi doktori fokozatának megszerzéséhez Peter Hoffmann, Stuttgart Bad Cannstatt 2010
Dean: Dr. professzor I. B. Autenrieth 1. előadó: professzor Dr. Dr. R. Weissert 2. előadó: Dr. professzor T. Gasser
Tartalomjegyzék 1 Rövidítések listája 1 2 Bevezetés és kérdés 3 2.1 Komplex genetikai autoimmun betegségek 3 2.1.1 Definíció és epidemiológia 3 2.1.2 Etiológia és patogenezis 3 2.2 Myasthenia gravis és protein tirozin-foszfatáz nem-receptor 22 6 2.2.1 Myasthenia gravis 6 2.2.1.1 Definíció 6 2.2.1.2 Epidemiológia 6 2.2.1.3 Tünetek 6 2.2.1.4 Tanfolyam 7 2.2.1.5 Újszülött myasthenia gravis 8 2.2.1.6 Kísérő betegségek 8 2.2.1.7 Neuromuscularis átvitel 8 2.2.1.8 Patogenezis 10 2.2.1.9 A thymus jelentősége 11 2.2.1.10 klinikai osztályozások és pontszámok 12 2.2.1.10.1 Osztályozás Ossermann és Genkins szerint 12 2.2.1.10.2 Myasthenia Gravis pontszám Besinger szerint 13 2.2.1.11 Diagnosztika 13 2.2.1.11.1 Farmakológiai tesztelés 13 2.2.1.11.2 Ismétlődő stimuláció elektromiográfiával 13 Antitest diagnosztika 14 2.2.1.12 Terápia 15 2.2.1.12.1 Acetilkolinészteráz inhibitorok 15 2.2.1.12.2 Immunszuppresszív terápia 16 2.2.1.12.3 Thymectomia 16 2.2.2 Fehérje-tirozin-foszfatáz nem-receptor 22 17 2.2.3 Kutatási kérdés 18 2.3 Sclerosis multiplex/malária és a neutrofil citoszolos faktor 1 19 I.
2.3.1 Sclerosis multiplex 19 2.3.1.1 Definíció 19 2.3.1.2 Epidemiológia 19 2.3.1.3 Betegség kép 20 2.3.1.4 Kurzusformák 20 2.3.1.5 Diagnosztikai kritériumok 21 2.3.1.6 Prognózis 24 2.3.1.7 Patogenezis 25 2.3.1.8 Diagnosztika 27 2.3.1.8. 1 CSF diagnosztika 27 2.3.1.8.2 Elektromos élettani diagnosztika 28 2.3.1.8.3 Mágneses rezonancia tomográfia 28 2.3.1.8.4 A fogyatékosság értékelésére szolgáló skálák 28 2.3.1.9 Terápia 28 2.3.2 Malária 31 2.3.2.1 Definíció 31 2.3.2.2 Epidemiológia 31 2.3 .2.3 A parazita fejlődési ciklusa 31 2.3.2.4 Tünetek 32 2.3.2.5 Terápia 33 2.3.3 Reaktív oxigén metabolitok 33 2.3.4 Neutrofil citozol faktor 1 35 2.3.4.1 Definíció 35 2.3.4.2 NADPH oxidáz 35 2.3.4.3 CF1 gén és pszeudogének 36 2.3.4.4 NCF1 és autoimmun betegségek 40 2.3.5 Kutatási kérdés 40 3 Anyag és módszerek 41 3.1 Myasthenia gravis és PTPN22 41 3.1.1 Betegek 41 3.1.2 Anyag és felszerelés 41 3.1.2.1 SNP genotipizálás 41 II
3.1.2.2 Elisa Titin-ellenes antitest 41 3.1.2.3 Anti-AChR antitest radioimmunassay 42 3.1.3 Módszerek 42 3.1.3.1 SNP genotipizálás 42 3.1.3.1.1 SNP genotipizáló keverék 42 3.1.3.1.2 Taqman Universal Master Mix 43 3.1.3.1.3 Polimeráz láncreakció, 43. elv 3.1.3.1.4 Genotipizálás, 43 elv, 3.1.3.1.5 Polimeráz láncreakció, megvalósítás 45 3.1.3.2 Antitin antitest ELISA 46 3.1.3.2.1 Enzimhez kapcsolt immunszorbens teszt, 46. Elv 3.1.3.2.2 Anti-titin antitest ELISA 46 3.1.3.3 Anti-AChR antitest radioimmun vizsgálat 48 3.1.3.4 Statisztikai elemzés 48 3.2 NCF1 és sclerosis multiplex/malária 49 3.2.1 Betegpopuláció 49 3.2.2 Anyag és felszerelés 50 3.2.2.1 DNS-elválasztás az emberi teljes vértől 50 3.2.2.2 NCF1 genotipizálás 50 3.2.2.3 Agaróz gél elektroforézis 51 3.2.2.4 A monociták és a granulociták sejtszeparálása 51 3.2.2.5 A perifériás vér polimorfonukleáris és mononukleáris sejtjeinek számlálása és hígítása 52 3.2. 2.6. Antitest jelölése R-fikoeritrinnel 52 3.2.2.7 Bradford-teszt 53 3.2.2.8 Monociták és granulociták festése R-PE-jelölt p47-phox (D-10) antitestekkel 53 3.2.3 Módszerek 53 3.2.3.1 DNS-elválasztás az emberi teljes vértől 53 3.2. 3.2 NCF1 genotipizálás 54 3.2.3.2.1 Taqman Universal Master Mix 54 3.2.3.2.2 Polimeráz láncreakció 55 III
3.2.3.2.3 Genotipizálás 55 3.2.3.3 Agaróz gél elektroforézis 56 3.2.3.4 Monociták és granulociták sejtszeparálása 56 3.2.3.4.1 Sejtszeparáció 56 3.2.3.4.2 Monociták és limfociták elválasztása 57 3.2.3.4.3 Granulociták 57 3.2.3.5 A PMN-ek és PBMC-k számlálása és hígítása 58 3.2.3.6 Az antitest R-fikoeritrinnel történő jelölése 58 3.2.3.6.1 p47-phox (D-10): sc-17845 58 3.2.3.6.2 Jelölés 58 3.2 .3.7 Bradford-teszt 59 3.2.3.7.1 59. elv 3.2.3.7.2 60. eljárás 3.2.3.8 Monociták és granulociták festése R-PE-jelölt p47-phox (D-10) antitestekkel 60 3.2.3.9 Áramlási citometria/Fluoreszcenciával aktivált sejtrendezés 61 3.2.3.9.1 Alapelv 61 3.2.3.9.2 Áramlási citometria 61 3.2.3.10 Statisztikai elemzés 62 3.2.3.10.1 Malária 62 3.2.3.10.2 Szklerózis multiplex 62 4 Eredmények 63 4.1 Myasthenia gravis és PTPN22 63 4.1.1 Mérési eredmények 63 4.1.2 Allél gyakorisága és genotípus eloszlása 63 4.1.3 Allél gyakorisága SM betegek alcsoportjaiban 64 4.2 NCF1 és többszörös Szklerózis/malária 66 4.2.1 GT/GTGT hányados és MS 66 4.2.2 GT/GTGT hányados társul az MS 66 4.2.3 GT/GTGT hányadosai és a malária szubfenotípusaival 69 4.2.4 GT/GTGT korreláció Mérték a malária betegek ROS termelésével 70 IV
4.2.5 GT/GTGT hányadosok és hemoglobin-koncentráció 70 4.2.6 Monociták, limfociták és granulociták áramlási citometriája 71 5 Megbeszélés 73 5.1 Myasthenia gravis és PTPN22 73 5.1.1 Bevezetés 73 5.1.2 A PTPN22 polimorfizmus asszociációja myasthenia gravisszal 73 5.1.3 A PTPN22 polimorfizmus asszociációja anti-AChR antitestek és anti-titin antitestek előfordulásával 73 5.1.4 Anti-titin antitestek és timómák 74 5.1.5 Genotípusok a timoma státusától függően 75 5.1.6 A thymoma nélküli MG betegek alcsoportjának elemzése 75 5.1.7 Eredményeink összehasonlítása a korábbi vizsgálatokkal 76 5.1.8 Összefoglalás és kilátások 78 5.2 NCF1 és sclerosis multiplex/malária 79 5.2.1 Bevezetés 79 5.2.2 GT/GTGT hányadosok sclerosis multiplexben szenvedő betegeknél 79 5.2.3 GT/GTGT hányadok malária betegeknél és összehasonlítás ROS termeléssel 80 5.2.4 A módszer kritikája 81 5.2.4.1 Az NCF1 fragmensek genotipizálása 81 5.2.4.2 Monociták, limfociták és granulociták áramlási citometriája 82 5.2 .5 Összefoglalás és kitekintés 82 6 Összefoglalás 83 6.1 Myasthenia Gravis és PTPN22 83 6.2 NCF1 és sclerosis multiplex 84 6.3 NCF1 és malária 85 7 Irodalomjegyzék 86 Köszönetnyilvánítás 104 Curriculum Vitae 105 V
Rövidítések listája 1 Rövidítések listája ACh = acetilkolin AChR = acetilkolin receptor AIE = autoimmun betegségek BSA = szarvasmarha szérum albumin CTLA4 = citotoxikus T-limfocita antigén 4 DNS = Deoxyribonucleic Acid EAE = Kísérleti Autoimmun Encephalomy = Fanderster = F kísérleti humán leukocita antigén IVIg = intravénás immunglobulinok KI = konfidencia intervallum LYP = limfoid tirozin-foszfatáz MG = myasthenia gravis MGB = kisebb horonykötő MHC = fő hisztokompatibilitási komplex MRT = mágneses rezonancia képalkotás MS = sclerosis multiplex NADPH = nikotinamid-citofoszfát-faktor 1 OR NADPH 1 Páratlan s arány P47-phox = Protein47 fagocita-oxidáz PBMC = perifériás vér mononukleáris sejtek PBS = foszfáttal pufferolt fiziológiás sóoldat PCR = polimeráz láncreakció Phox = fagocita ox idáz PMA = phorbol-12-mirisztát-13-acetát PMN = polimorf magsejtek 1
Rövidítések listája PTPN22 = fehérjetirozin-foszfatáz-nem-receptor 22 RA = reumás ízületi gyulladás ROS = reaktív oxigén-metabolitok (reaktív oxigén fajok) R-PE = R-phikoeritrin SSC = oldalsó szórás SLE = szisztémás lupus erythematosus SNP = egy nukleotid polimorfizmus 2
Bevezetés és kutatási kérdés 2.2.1.8 Patogenezis MG esetén az AChR ioncsatorna sűrűsége csökken az izomvéglemezen [Pestronk et al., 1985], és a véglemez megsemmisül. Az idegvég és a posztszinaptikus izomhártya közötti szinaptikus rés növekszik [Engel és mtsai, 1976]. Az autoantitestek által összekapcsolt AChR ioncsatornák gyorsabban endocitálódnak és bomlanak le. A komplement által közvetített antitestkötés a posztszinaptikus készülék pusztulásához vezet, a posztszinaptikus ujjkészülék csökkenésével (lásd 2. ábra). Az AChR antitestek közvetlenül blokkolják az AChR ioncsatornát [Köhler et al., 2003]. A csökkent megnyitott AChR ioncsatornák száma alacsonyabb potenciált eredményez az izmos véglemezben, ami már nem elegendő az akciós potenciál létrehozásához. Az aktivált izomrostok alacsonyabb száma a fent leírt izomgyengeséghez vezet. A pusztán szembetegségben szenvedő betegeknél is csökken az AchR a végtagok véglemezén, ami azonban továbbra is szubklinikus. A: egészséges neuromuszkuláris transzmisszió B: neuromuszkuláris transzmisszió myasthenia gravisban 2. ábra: Neuromuszkuláris transzmisszió [Drachman, D. B., 1994] 10
Bevezetés és kutatási kérdés 2.2.1.9 A thymus jelentősége MG-s betegeknél a thymus gyakran morfológiailag megváltozik. Van thymitis lymphofollicularis hyperplasiaval, thymus atrophiával vagy thymomával. Ennek az összefüggésnek az egyik oka lehet egy antigén molekuláris utánzás: az AChR ioncsatornák epitópjaihoz hasonló saját vagy exogén antigének aktiválják az autoreaktív T-sejteket. A herpes simplex vírusok vagy bakteriális fertőzések olyan komponensei, amelyekben az MG indukcióját tárgyalják, exogén antigénekként használhatók [Schwimmbeck és mtsai., 1989]. A rosszindulatú thymomában megnövekedett a neurofilamentumok expressziója, amelyek autoantigén determinánsként működhetnek, mivel AChR-szerű epitópjuk van. Az egyik a MG-ben szenvedő betegek 8,5-15% -ában talál thymomákat [Wilkins et al. 1999, Loehrer 1999, Otto 1998]. 11.
Bevezetés és kutatási kérdés 2.2.1.10. Klinikai osztályozások és pontszámok 2.2.1.10.1 Osztályozás Ossermann és Genkins szerint Az Osserman és Genkins szerinti osztályozást (lásd 1. táblázat) az MG-betegség súlyosságának felmérésére hozták létre. 1. táblázat: A myasthenia gravis osztályozása Ossermann és Genkins (1971) osztály szerint Klinikai forma Tünetek I Szemészeti forma Ptosis, diplopia IIa Enyhe általánosított forma Enyhe generalizált gyengeség IIb Faciopharyngealis forma IIa + bulbar gyengeség III Súlyos akut generalizált forma Akut súlyos generalizált gyengeség, bulbar tünetek, IV légzési elégtelenség súlyos krónikus generalizált forma súlyos, gyakran progresszív generalizált gyengeség 12
Az MG bevezetését és kérdését leginkább oropharyngealis gyengeség és kevesebb szemtünet jellemzi [Evoli et al., 2003]. 2.2.1.12 Terápia Az MG kezelése a következő oszlopokon alapszik [Köhler és mtsai., 2003]: - ACh észteráz inhibitorok beadása, amelyek javítják a neuromuszkuláris transzmissziót. - Immunszuppresszív vagy immunmoduláló terápia az antigén antitestek csökkentésére. -Komplex kiváltott gyulladásos reakció - Intervenciós terápiás intézkedések az akut állapotromlás, például myasthenikus krízis, pl. terápiás plazmacsere plazmaferezissel vagy immunadszorpcióval [Shibuya et al., 1994] - timektómia hidrolizált. A karbamilcsoport kovalensen átkerül az ACh észterázba, és órákig gátolja az enzimaktivitást. A szinaptikus résben az ACh-ellátás növekszik, és az ACh-nak több ideje van a posztszinaptikus membrán kötőhelyeinek elfoglalására. A leggyakoribb hatóanyag a piridostigmin-bromid (Mestinon) legfeljebb 300 mg/nap dózisban. 15-én
A beavatást és a kérdezést akkor diagnosztizálják, ha a léziók időbeli és térbeli elterjedése van, pl. képalkotással detektálható (lásd a 2. táblázatot). Az SM diagnosztizálásához hasonló klinikai képeket (pl. Kollagenózis, vasculitis, borreliosis vagy szarkoid) ki kell zárni. Az SM az, amikor a kritériumok teljesülnek, és nincs jobb magyarázat a klinikai tünetekre. Lehetséges tagállam, amikor gyanú merül fel, de a kritériumok nem teljesülnek teljes mértékben. 22-én
Bevezetés és kutatási kérdés FAD = flavin-adenin-dinukleotid Fe = vas GDI = guanozin-difoszfát disszociáció-gátló GDP = guanozin-difoszfát GTP = guanozin-trifoszfát NADPH = nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát a membránhoz kötött egységek gp91-phox és p22-phox. Az aktiváláshoz szükséges a p47-phox és a membránhoz kötött egységek közötti kölcsönhatás. Először is, a Rac fehérjének el kell válnia a Rho GDI fehérjétől, és a GTP által aktivált állapotba kell lépnie. Akkor ez kapcsolatba kerülhet a plazmamembránnal. A plazmakomplexumhoz több foszforilációra van szükség, hogy kapcsolódjon a membránhoz kötött egységekhez. Az aktivált NADPH-oxidáz szuperoxid-anionokat termel, amelyek felszabadulnak a fagocita vezikulákba vagy az extracelluláris térbe [Heyworth et al., 2003]. 3. ábra: A NADPH-oxidáz aktiválása [Heyworth et al. 2003] 37
Bevezetés és kutatási kérdés Az emberi genomban két pszeudogén (ψncf1) található NCF1 génenként, ezek 98% -ban megegyeznek az NCF1 génnel és ugyanazon a 7q11.23 régióban helyezkednek el a 7. kromoszómán [Heyworth, Cross et al., 2003]. Megkülönböztetünk I. típusú ogenenncf1-et, amely tartalmazza a GT-deléciót a 2. exon elején, és II-es típusú ψncf1-et, amely nem tartalmaz GT-deléciót [Heyworth, Noack et al., 2002]. A populációban általában két különböző haplotípus létezik, a gyakoribb haplotípus két I. típusú ψncf1 és egy NCF1 másolattal, a kevésbé gyakori haplotípus pedig egy-egy I. és II. Típusú ψncf1 példánnyal és egy funkcionális gén egy példányával [Heyworth et al., 2002]. A GT mutáció gyakori előfordulása krónikus granulomatosisban hipotetikusan magyarázható az NCF1 és az I typencf1 típusú rekombinációs eseményekkel (lásd 4. ábra). Közelségük és nagyfokú hasonlóságuk miatt az ilyen rekombinációs események gyakrabban fordulhatnak elő. A II. Típusú ψncf1 valószínűleg az NCF1 és az I. típusú ψncf1 közötti rekombinációból származik. 4. ábra, az NCF1 és az I. típusú ψncf1 lehetséges keresztezésének modellje [Heyworth és mtsai., 2003] 38