Az emberi aorta perivaszkuláris zsírsejt progenitor sejtjeinek differenciálódási kapacitása (fordítva

Összegzés

Ennek a protokollnak a célja annak vizsgálata, hogy az emberi perivaszkuláris zsírszövetből származó progenitor sejtek képesek-e a sejt több vonalára differenciálódni. A differenciálódást összehasonlítottuk az emberi csontvelő mesenchymális őssejtjeivel, amelyekről ismert, hogy adipocita, oszteocita és porc sejtvonalakra differenciálódnak.

Absztrakt

Bevezetés

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Jegyzőkönyv

Az emberi szövetek felhasználását ebben a vizsgálatban a Maine Orvosi Központ Intézményi Felülvizsgálati Testülete értékelte és jóváhagyta, és az összes személyzet megfelelő képzést kapott a kísérletek előtt.

2. 1. protokoll: Humán PVAT-sejtek tenyésztése a sztróma érrendszeri repedéséből

Jegyzet: A PVAT-t a graft anastomosis helyétől a felemelkedő aortáig reszektálják érzéstelenített betegen, koszorúér bypass angioplasztikával. Az Aorta PVAT-ot egy 15 ml-es kúpba helyezzük, 10 ml jéghideg magas glükózszintű DMEM-F12-vel, és a műtőből a reszekciót követő 2 órán belül laboratóriumba viszik. Az aorta PVAT-t a bypass-eljárások során eldobják a szövetből, és a Maine Orvosi Központ belső ellenőrzési osztálya nem emberként kutatja.

Ez a protokoll a

500 mg emberi PVAT-darab (kb. 3 x 1 x 0,5 cm 3). Vigye át a friss emberi PVAT-ot a DMEM-ből egy 50 ml-es kúpos csőbe, amely 25 ml antibiotikus oldatot tartalmaz. Inkubáljuk rockigennel 20 percig 4 ° C-on. Amíg a PVAT antibiotikus oldatban van, a disszociációs puffer egy alikvot részét 37 ° C-on felolvasztjuk. Adjunk hozzá 5 ml disszociációs puffert, 50 µl 100 x antibiotikum/gombaellenes oldatot, és sterilizáljuk 0,22 µm-es fecskendőszűrővel. 1 adjunk hozzá 1 ml zselatinoldatot is egy 24 üregű lemezről. Lamináris átáramló burkolatban steril csipesszel és ollóval vigye át a PVAT-ot az antibiotikus oldatból egy steril Petri-csészébe. Adjon 1 ml előmelegített disszociációs puffert a szövethez, és az egész szövetet finomra vágja szuszpenzióvá (ne legyen nagyobb, mint

Adjunk hozzá 1 ml friss táptalajt, és osszunk el 500 µl-t, 2 üreget egy 24-lyukú lemezről, mindegyikben 500 µl táptalaj és 25 ng FGF2.

A humán PVAT-ból nyert sejtek tovább terjeszkednek, az előző lépésben leírtak szerint. Minden szakasz nem lehet nagyobb 1: 2 aránynál. A sejteket 5-7-szer passzáltuk, mielőtt azokat differenciálási vizsgálatokhoz allokáltuk volna.

3. 2. protokoll: Emberi csontvelő tenyésztése MSC telepek

Jegyzet: Az emberi csontvelő MSC-jét a 8. leírás szerint izoláltuk, és korai passzázsállományként fagyasztott fagyasztó közegben tároltuk (70% FBS, 20% bazális DMEM és 10% DMSO).

100 000 sejt/ml folyékony N2-ben.

1. Gyorsan felolvasztjuk az MSC csontvelő fioláját a folyékony N2-ből 37 ° C-os vízfürdőben, majd a lemezt egy 6-lyukú tenyésztőlemez mélyedésére 3 ml MSC-táptalajjal, majd egy éjszakán át inkubáljuk 37 ° C-on és 5% CO2-on.
2. Másnap szívja le az MSC táptalajt, és mossa meg a sejteket háromszor 2 ml HBSS-ben. 100% -os összefolyásnál szívja fel a táptalajt, és mossa le a sejteket háromszor 2 ml HBSS-ben. Adjon hozzá 500 µl/üreg cellasejt-oldatot, és inkubálja 37 ° C-on és 5% CO2-nál 5 percig. Érintse meg a lemezt annak biztosítása érdekében, hogy az összes sejt elmozduljon és tartalma egy 6-lyukú lemezen legyen, 2 ml MSC-táptalajjal egyenletesen 2 üregben terjeszteni.
3. Táguljon párhuzamosan az emberi csontvelőben és a PVAT-eredetű MSC-ben kb. 5–7 passzázsig, vagy amíg a vizsgálathoz elegendő mennyiséget el nem érnek.

4. 3. jegyzőkönyv: Adipogén, oszteogén és kondrogén vonalak lemezesítése és kiváltása

Megfelelő csontvelő- és PVAT-sejtek száma, amelyeket egy 12-lyukú lemez lyukánként kapunk és minden kísérleti körülményhez megfelelően replikálunk. Adipogén és oszteogén állapotok esetén,

5. 4. jegyzőkönyv: Adipogén, oszteogén és kondrogén vonalak tenyésztése 14 napig

6. 5. jegyzőkönyv: az adipogén állapot festése olajvörös O-val

7. 6. jegyzőkönyv: az oszteogén állapot festése alizarinvörös színnel

1. Távolítson el minden folyadékot minden egyes kútból. Adjon megfelelő mennyiségű 2% -os alizarin vörös foltos oldatot minden üregbe (1,5 ml/üreg 12-lyukas lemezhez), és óvatosan döntse meg a lemezt egyik oldalról a másikra, amíg az oldat teljesen el nem fedi a kút alját.
2. Inkubáljuk 15 percig szobahőmérsékleten. Távolítsa el az alizarin vöröset a kútból. Minden egyes üreget ötször öblítsen desztillált H2O-val, ügyelve arra, hogy a kalciumkristályokat ne szorítsa ki finoman. hagyjuk megszáradni.

8. 7. jegyzőkönyv: Chondrogén állapot festése Masson Trichrommal

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Reprezentatív eredmények

A sztrómasejt vaszkuláris frakciójának izolálása humán PVAT-ból

1A. Ábra ábra mutatja az anatómiai régió vázlatos ábrázolását, amely meghatározta az emelkedő aorta PVAT-t. A koszorúér bypass műtét betegcsoportjait, ezeket a 6-ból származó mintákat korábban leírtuk - 1b. Ábra a műtét után kapott humán PVAT példáját mutatja be. 1. ábra a PVAT szövet reprezentatív szakaszát mutatja, amelyet Masson Trichrome festéssel festettek. 1. ábra egy fázis-kontraktus mikrográf, amely a PVAT-ból származó sztrómasejtek populációját mutatja a differenciálódást megelőző expanziós szakaszban. A sejtek bővíthetők és fagyaszthatók későbbi felhasználás céljából. A sejtek általában 2,5 x 105 sejt/ml sűrűségűek, 70% fagyasztott FBS-t, 20% bazális (antibiotikummentes) DMEM-F12 és 10% DMSO-t tartalmazó táptalajban egy izopropanol-kamrában. 80 ° C-on 24 órán át, majd a folyékony N2 fagyasztó folyadékfázisába került hosszú távú tárolás céljából.

Adipogén differenciálás

MSC párhuzamosan az emberi csontvelővel (2A. ÁbraB.) és PVAT-eredetű progenitor sejtek (2. ábraD.) vizsgálatokat végeztek. A 2. ábra bal oldali paneljei mutassa meg az indukált állapotot, ahol nem nyilvánvaló a lipid felhalmozódása. A megfelelő lemezeken az adipocita differenciálódás és a semleges lipidek olajvörös O-val történő festése mutatja a sejteket. Míg az emberi aorta szelep differenciáltságának mértéke erőteljesebb a PVAT-eredetű sejtekben, mindkét forrás megmutatta az emberi sejtnek az adipogén vonal irányában történő differenciálódás képességét.

Osteogén differenciálás

Az oszteogén differenciálási protokollt alkalmazták az emberi csontvelő eredetű MSC-n (3A. Ábra-C.) és a PVAT-tal gyűjtött sejtek (3D ábra- F) használt. Nem indukált sejtek (3A. ÁbraD.) ne foltozzon vörösre alizarinnal. Az oszteogén differenciálódási protokoll szerint az emberi MSC kifejlesztett meszes csomókat, amelyeket alizarinnal vörösre festettek (3b. Ábra- C), míg az emberi aorta PVAT-ból származó sejtjei nem (3E. ábra)-F.). Ezek az adatok azt sugallják, hogy az emberi PVAT stromalis vaszkuláris repedéséből történő sejtek előállítása során számos előd hiányzik, akik képesek lennének osteogenezisre. A vizsgálattól és a differenciálás időbeli lefolyásától függően célszerű a standard foltokat nyomon követni olyan molekuláris markerek detektálásával, amelyek meghatározzák a csontképző vonalak érintettségét (pl. RUNX2, Osterix, alkalikus foszfatáz) vagy osteoblastokat (osteopontin, osteocalcin, alkalikus foszfatáz, BAP1).

Kondrogén differenciálás

Sejtek mindkét emberi csontvelő MSC-ből (4A. Ábra) és humán PVAT (4b. ábra)) mutatják a kondrogén differenciálódásra jellemző jellemzőket, a mikromasszában bőséges kollagén felhalmozódással. Az emberi csontvelő MSC-ből és az aorta PVAT-ból származó sejtekből képzett mikromasszázsok szintén bőségesen felhalmozódtak a glikozaminoglikánokban (kék), amit Alcian-kék festés jelez (4. ábra).-D., illetőleg). Morfológiailag a struktúrák hasonlóak voltak a kollagén lerakódás által létrehozott üregekben levő résekhez (4. ábra), Nyilak) körülvevő sejtek. A vizsgálattól és a differenciálás időbeli lefolyásától függően bizonyos kondrogén markerek (aggrekán, II. Típusú kollagén, oszteonektin, Sox9) kimutatása hasznos.

1. ábra: Az emberi PVAT morfológiai jellemzői. (A.) Az emberi aorta (piros) rajzfilm ábrázolása a környező PVAT-tal (sárga). A nyíl az emelkedő aortát mutatja. (B.) 480 mg darab humán aorta szelep PVAT egy CABG betegből DMEM-ben a disszociáció előtt. (C.) Masson formalinnal fixált, paraffinba ágyazott humán PVAT trichromfoltja (sötétbarna/fekete = magok, kék/lila = kötőszövet, rózsaszín = citoplazma; vegye figyelembe, hogy a vörösvértestek vöröses-rózsaszínűek.)D.) Az explantált PVAT sztrómasejtek reprezentatív képe a tenyészet 7 napján. Kattintson ide az ábra nagyobb változatának megtekintéséhez.

2. ábra: adipogén differenciálás. (A.) Az emberi csontvelő MSC fázismikroszkópiája indukálatlan állapotban nem mutat diferenciáltságot. (B.) Az emberi csontvelő MSC fázismikroszkópiája indukált adipogén állapotban a semleges lipidek differenciálódását és immobilizálását mutatja, olajvörös O-val festve 14 nap után. (C.) A humán aorta PVAT-ból származó sejtek fázismikroszkópiája nem indukált adipogén állapotban nem mutat differenciáltságot. (D.) Az indukált adipogén állapotú humán aorta PVAT-ból származó sejtek fázismikroszkópiája 14 nap után olajvörös O-val festett semleges lipidek robusztus differenciálódását és immobilizálását mutatja. Kattintson ide az ábra nagyobb változatának megtekintéséhez.

4. ábra: Kondrogén differenciálás. (A, B) Az emberi csontvelő MSC (A) vagy az emberi aorta szelep PVAT progenitor sejtjei (B) által képviselt mikromasszázs metszetének fénymikroszkópiája 14 nap tenyésztés után indukált kondrogén állapotban, majd Masson Trichrome-tal festettük, ami a kollagén (kék) jelentős lerakódására utal, és sikeres differenciálást javasol a kondrogén származás felé. (C, D) Az emberi csontvelő MSC (C) vagy az emberi aorta szelep PVAT prekurzor sejtjei (D) által képviselt mikromasszázs metszetének fénymikroszkópiája 14 nap tenyésztés után indukált kondrogén állapotban, majd Alciannal kék színnel festett, ami savas proteoglikánok (pl. B. glycosaminoglycans), mint általában a porcban találhatók. Ellentétes, gyorsan atomvörös; Nyilak, résszerű szerkezetek. Kattintson ide az ábra nagyobb változatának megtekintéséhez.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Vita

A zsírszövet őssejtjei a regeneratív gyógyászati ​​alkalmazások középpontjába kerültek, a könnyű hozzáférés és a zsírszövetből származó sejtek nagy száma miatt 12, 13. Vaszkuláris sejtek, gyulladásos sejtek, fibroblasztok, preadipociták és zsírszövet őssejtek találhatók a zsírszövet stromális sejtjeinek vaszkuláris részében. Különbségek vannak az őssejtpopulációban a zsírraktár anatómiai elhelyezkedése és az adipocita tulajdonságok alapján 14. Ami a legfontosabb, hogy a zsírszövetből származó őssejtek úgy tűnik, hogy képesek megkülönböztetni nemcsak a 15 mezenhimális vonalat, hanem képesek feltételezni a neurális 16, 17 és epidermális 18 sorsokat is.

Számos tanulmány foglalkozott az emberi szubkután fehér zsírszövetből származó ős/progenitor sejtekkel, de kevés tanulmány foglalkozott a PVAT progenitor populációk jellemzőivel. A legújabb vizsgálatok a mesenterialis ereket vagy a patkány mellkasi aortáját körülvevő PVAT-ból izoláltak adipocita progenitor sejteket. Míg ezek a CD34 +/CD140a + populációk adipocitákká differenciálódnak, más vonalak vonzásának képességét nem tesztelték 19 .

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Közzétételek

A szerzők nem árultak el semmit.

Köszönetnyilvánítás

Elismerjük a Maine Medical Center navigációs kutatásának támogatását a klinikai szövetek megszerzéséhez, valamint a hisztopatológiai és hisztomorfometriai mag (1P20GM121301, L. Liaw PI támogatásával) támogatásához a Maine Medical Center Vágás és Foltozás Kutatóintézetében. Ezt a munkát az NIH Grant R01 HL141149 (L. Liaw) támogatta.

---