Az ICAM-1 gén expressziójának gátlása hármas hélix oligonukleotidokkal - PDF Free Download
A müncheni Ludwig Maximilians Egyetem Dermatológiai és Allergológiai Klinikájáról és Poliklinikájáról igazgató: Prof. Dr. med. Dr. h.c. G. Plewig Az ICAM-1 génexpresszió gátlása hármas hélix oligonukleotidokkal
A Müncheni Egyetem Orvostudományi Karának jóváhagyásával.Riporter: Prof. Dr. K. Degitz 2. Előadó: Prof. Dr. Becker P. B. Társriporter: A doktori alkalmazott felügyelete: Dékán: Priv.-Doz. G. Hartmann Prof. Dr. Th. Brocker Dr. C. marsall Prof. Dr. Dr. h.c. K. Peter szóbeli vizsga napja: 2003. július 28
Az ICAM-1 gén expressziójának gátlása hármas helix oligonukleotidokkal
E munka részei a következő publikáció részét képezik: Besch, R., Giovannangeli, C., Kammerbauer, C., Degitz, K. A triplexet képző oligonukleotidokkal történő génmegcélzás által közvetített ICAM-1 expresszió specifikus gátlása J. Biol. Chem. 2002; 277: 32473-32479
Tartalomjegyzék BEVEZETÉS 1. Hármas hélix szerkezetek felfedezése. 1 2. Géngátlás oligonukleotidokkal. 2 2.1 Gén-gátlás tripla helix oligonukleotidokkal. 2 2.2 Gén-gátlás antiszensz oligonukleotidokkal. 3 3. A hármas spirál felépítése. 4 4. Hármas hélix oligonukleotidok célszekvenciái. 5 5. Hármas hélix oligonukleotidok. 6 5.1 A hármas hélix oligonukleotidok tervezésének alapvető szempontjai 6 5.1.1 A bázis hármasok orientációja. 6 5.1.2 Az alaphármasok kötési szöge és hossza. 7 5.1.3 Az egyes bázishármasok tulajdonságai és stabilitása. 8 5.2 Hármas hélix oligonukleotidok. 8 5.2.1 Pirimidin típusú hármas hélix oligonukleotidok. 9 5.2.2 Purin típusú hármas hélix oligonukleotidok. 9 6. A Triple Helix oligonukleotidok módosulása. 10 6.1 Az alapok módosítása. 10 6.2 A gerinc módosítása. 10 6.3 A végek módosítása. 11 7. Hármas hélix technológia. 13 7.1 A hármas hélix oligonukleotidok biológiai aktivitása. 13 7.2 A hármas hélix kialakulásának bizonyítékai. 14 1 Tartalomjegyzék
8. Sejtadhéziós molekulák. 14 immunglobulin szupercsalád. 15 integrin. 16 szelektin. 16 kadherin. 17 9. Az ICAM-1 sejtadhéziós molekula. 17 9.1 Az ICAM-1 előfordulása és szabályozása. 17 9.2 Az ICAM-1 immunológiai funkciója. 18 9.3 Az ICAM-1 gátlásának orvosi jelentősége. 19 9.3.1 Gyulladásos bőrbetegségek. 20 9.3.2 Egyéb gyulladásos betegségek. 21 9.3.3 Védekezés az átültetett szervek kilökődése ellen. 21 9.4 Az ICAM-1 fehérje szerkezete. 22 9.5 Az ICAM-1 génszerkezete. 23 ANYAG ÉS MÓDSZEREK 1. Anyagok. 24 1.1 Vegyszerek és oldószerek. 24 1.2 Enzimek. 25 1.2.1 Korlátozó enzimek. 25 1.2.2 Egyéb enzimek. 25 1.3 Antitestek. 25 1.4 Plazmák. 26 1.5 Biológiai anyag. 26 1.5.1 Prokarióta sejtek. 26 1.5.2 Eukarióta sejtek. 26 1.6 Táptalajok és tápközeg-adalékok az eukarióta sejtek tenyésztéséhez. 26 2 Tartalomjegyzék
1,7 oligonukleotid. 27 1.7.1 Hármas hélix és kontroll oligonukleotidok. 27 1.7.2 Oligonukleotidok a célszekvenciák előállításához, 27 1.7.3 Oligonukleotidok primerekként. 28 1.8 Komplett kereskedelmi rendszerek. 29 1.9 Fogyóeszközök. 29 1.10 Eszközök. 30 1.11 Szoftver. 30 2. Módszerek. 31 2.1 DNS-technikák. 31 2.1.1. A nukleinsavak általános kezelése. 31 2.1.1.1. DNS-tisztítás fenolos extrakcióval. 31 2.1.1.2 DNS-kicsapás. 31 2.1.1.3 Gélelektroforézis agarózgélekkel. 31 2.1.1.4. DNS-sávok denzitometriai értékelése. 32 2.1.1.5 DNS-fragmensek izolálása agaróz gélekről. 32 2.1.1.6 DNS-tisztítás szilikátmembránokkal. 33 2.1.1.7. A nukleinsavak koncentrációjának meghatározása. 33 2.1.2 Genomikus DNS előállítása A431 sejtekből. 33 2.1.2.1. Genom DNS előállítása anioncserélő oszlopokkal. 34 2.1.2.2 Genom DNS előállítása szilikát membrán oszlopokkal. 34 2.1.3 Polimeráz láncreakció. 35 2.1.4 A nukleinsavak jelölése digoxigeninnel (DIG). 36 2.1.4.1. A nukleinsavak belső jelölése. 36 2.1.4.2 A nukleinsavak 3 végének jelölése. 36 2.1.5. Nukleinsavak átadása nejlonmembránokra (blotolás). 37 2.1.6 A DNS hibridizálása DIG-jelzett próbákkal (Southern-blotok). 37 2.1.7 DIG-jelölt nukleinsavak kimutatása. 37 3 Tartalomjegyzék
2,5 Hármas spirál bizonyíték. 51 2.5.1 Gél retardáció. 51 2.5.2 A restrikciós enzimek gátlása. 52 2.5.3 PCR-reakció gátlása. 52 2.5.4 Hármas spirálok detektálása mágneses elválasztással. 2.5.4.1 Hármas spirál detektálás izolált genomi DNS-en. 54 2.5.4.2. Hármas hélix kimutatása a sejtmagokban. 55 EREDMÉNYEK 1. Hármas helix oligonukleotidok célszekvenciái az ICAM-1 génben. 56 1.1 Megfelelő célszekvenciák azonosítása. 56 1.2 Különösen alkalmas célszekvenciák kiválasztása. 57 2. Hármas hélix oligonukleotidok kialakítása. 59 2.1 Hármas hélix oligonukleotidok a célszekvenciához 13. 59 2.2 Hármas hélix oligonukleotidok a célszekvenciához 17. 61 2.3 A kontroll oligonukleotidok tervezése. 62 3. Kötődési tanulmányok. 63 3.1 Megkötési vizsgálatok hármas hélix oligonukleotidokkal a célszekvenciához 13. 63 3.1.1 Megkötési vizsgálatok oligonukleotid célszekvenciákkal. 63 3.1.2. Megkötési vizsgálatok a plazmidon. 65 3.1.2.1. A pcm55 plazmid előállítása a 13. célszekvenciával. 65 3.1.2.2 Hármas spirál detektálás az EcoN I. gátlásával. 66 3.1.3. Megkötési vizsgálatok genomi DNS készítményekkel. 69 3.1.3.1 A Bfa I. restrikciós enzim gátlása. 69 3.1.3.2 Hármas spirál detektálása mágneses elválasztással. 70 3.1.4. Sejtmag-készítmények kötődési vizsgálata. 72 3.2 Hármas hélix oligonukleotidokkal történő kötődési vizsgálatok a célszekvenciához 17. 76 5 Tartalomjegyzék
3.2.1. Az oligonukleotid célszekvenciákkal kapcsolatos kötelező vizsgálatok. 76 3.2.2. Megkötési vizsgálatok plazmidokon. 79 4. A hármas hélix oligonukleotidok biológiai aktivitása. 81 4.1 Az ICAM-1 expresszió gátlása. 81 4.1.1 Az oligonukleotidok transzfekciós körülményeinek meghatározása 81 4.1.2 Az ICAM-1 gátlása TFO13GT-vel. 82 4.1.3 Az ICAM-1 gátlása a btfo13cu által. 86 4.1.4 Citotoxikus hatások vizsgálata. 87 4.2 A riporter gének gátlása. 89 4.2.1 A riporter plazmid klónozása. 89 4.2.2 A CAT expressziójának gátlása és az UVA sugárzás hatása. 92 4.2.3 További vizsgálatok a hármas hélix által közvetített géngátlás bizonyítására. 94 MEGBESZÉLÉS 1. Hármas hélix oligonukleotidok kötődési képessége. 96 1.1 Célszekvenciákat tartalmazó oligonukleotidok vizsgálata. 96 1.2 Célszekvenciákat tartalmazó plazmidok vizsgálata. 98 1.3 Genom DNS-sel kapcsolatos vizsgálatok. 99 2. Az ICAM-1 gátlása. 102 3. A hármas hélix oligonukleotidok aktivitása a modellrendszerben. 105 4. Az UVA-sugárzás hatása a hármas helix oligonukleotidok gén-gátlására. 106 5. Kitekintés. 108 ÖSSZEFOGLALÓ. 110 IRODALOMJEGYZÉK. 113 FÜGGELÉK. 126 6 Tartalomjegyzék
9.5 Az ICAM-1 génszerkezete Az ICAM-1 gén 7 exonból áll, amelyeket 6 intron szakít meg (11. ábra). Exon Intron Promoter 1 2 3 4 5 6 7 1000 bp 11. ábra: Az ICAM-1 gén. Az ICAM-1 gén arányos ábrázolása, az exonokat számozott dobozként kiemelve. Az első és a második intronban azokat a területeket, amelyeket az írás idején nem tettek közzé, perjelekkel jelölték. Az első intron teljes hossza körülbelül 4 kb, a második intron hosszabb, mint 2,6 kb. A lefordított terület szürke, lefordítatlan területeken fehér színnel jelenik meg. Néhány kisebb átfedéstől eltekintve a fehérje minden immunglobulin-szerű doménjét a körülbelül 300 bp hosszú exonok egyike kódolja (Degitz et al. 1991). Az 1-5 extracelluláris domének megfelelnek a 2-6 exonoknak, míg a fehérje transzmembrán és intracelluláris részét a 7 exon kódolja (Voraberger et al. 1991). A genomiális szerveződés és a fehérje doménekre osztása közötti szoros összefüggés az immunglobulin szupercsaládra jellemző (Staunton et al. 1988). 23 Bevezetés
1.2 Enzimek 1.2.1 Restrikciós enzimek 1.2.2 Egyéb enzimek megnevezzük a garnéla alkáli-foszfatázát Klenow-DNS-polimeráz I fragmens (St.Leon-Rot) peqlab (Erlangen) Promega (Heidelberg) peqlab (Erlangen) Roche Diagnostics (Mannheim) 1.3 Az antitest-restrikciós enzimeket a Roche Diagnostics (Mannheim), New England Biolabs (Schwalbach), MBI Fermentas (St.Leon-Rot) cégektől szereztük be. ) vagy a Hybaid-AGS-től (Heidelberg) szerezték be. Specifikusság Specificitás Címkézés Forrásforrás Humán ICAM-1 fluoreszcein-izotiocianát (FITC) MedSystems Diagnostics (Bécs, Ausztria) Humán HLA-DR R-Phycoerythrin BD Biosciences (Heidelberg) (PE) Egér IgG1 Fluorescein Isothiocyanate (Loterschulterterter) Egér IgG1 R-Phycoerythrin (PE) BD Biosciences (Heidelberg) 25 Anyag és módszerek
1.4. Plazmidok A riporter plazmidok klónozásának kiindulási plazmidjai a pcat ™ -Basic és a psv ™ -β-galaktozidáz Kontroll (Promega, Heidelberg) voltak. Staunton és munkatársai egy ICAM-1 cDNS-plazmidot (pg4h1) tartalmaznak, amely pgem TM -4Z-ből áll (Promega, Heidelberg), amelybe az EcoR I és Sal I alkalmazásával klónozták az ICAM-1 cDNS 2980 bp-os fragmentumát. al. 1.5 Biológiai anyag 1.5.1 Prokarióta sejtek Escherichia coli-t (DH5a törzs) alkalmaztunk a plazmid replikációjához. 1.5.2 Eukarióta sejtek Minden kísérletet az ATCC-től (Rockwille, Maryland, USA) nyert A431 sejtekkel végeztünk. 1.6 Táptalajok és tápközeg-adalékok az eukarióta sejtek tenyésztéséhez Név Név Amfotericin B Dulbecco módosított Eagle's Medium (DMEM) magzati borjúszérum (FCS) Hanks pufferolt sóoldat (HBSS) L-glutamin penicillin sztreptomicin tripszin (0,25%)/EDTA (1mM) forrás Technologies (Karlsruhe) Life Technologies (Karlsruhe) ccpro (Neustadt/Weinstrasse) Life Technologies (Karlsruhe) Life Technologies (Karlsruhe) Life Technologies (Karlsruhe) Life Technologies (Karlsruhe) Life Technologies (Karlsruhe) 26 Anyag és módszer
2.2. Hármas hélix oligonukleotidok a 17. célszekvenciához A 17. célszekvenciához antiparallel kötő purin típusú hármas hélix oligonukleotidokat fejlesztettünk ki. Ezek guaninból és adeninből (TFO17GA, 25. A ábra) vagy guaninból és timinből (TFO17GT, 25. B ábra) álltak. A 3'-TEG TFO17GA GGGGGGAAGGGAGGAAG psoralen C6 -5 '5'-CAGTTTTGGGGGGAAGGGAGGAATAAGGCCTC-3' 3'-GTCAAAACCCCCCTTCCCTCCTTATTCCGGAG-5 '3'-TEG B TFO17GT GGGGGGTTGGGTGGTTG psoralen C6 -5', 5'-CAGTTTTGGGGGGAAGGGAGGAATAAGGCCTC-3' 3'-GTCAAAACCCCCCTTCCCTCCTTATTCCGGAG- 5 '25. ábra: A TFO17GT és TFO17GA hármas hélix oligonukleotidok. A 25. A ábra a TFO17GA-t mutatja, amely anti-párhuzamosan kötődik a 17. célszekvencia purinszálához, és a 25. B ábra a TFO17GT-t, amely szintén anti-párhuzamosan kötődik. Mindkét oligonukleotid a kettős spirálhoz kötődik, fordított Hoogsteen hidrogénkötések képződésével. Az 5 végét psoralennel, a három végét trietilénglikollal módosítottuk. Mivel az 5 -TpA hely a homopurin szegmens 3-végén található, a pszoralen a hármas hélix oligonukleotid 5-végéhez kapcsolódik. A hármas hélix oligonukleotidban lévő guanin bázist hozzáadtuk az 5 végéhez annak érdekében, hogy a psoralen interkalációra alkalmas helyzetbe kerüljön. A szabad 3 végeket trietilénglikollal módosítottuk. 61 találat
2.3 Kontroll oligonukleotidok kialakítása Vegyes szekvenciájú oligonukleotidok, amelyek ugyanolyan hosszúak és azonos bázisösszetételűek, mint a megfelelő hármas hélix oligonukleotidok (kódolt kontroll), kontrollként szolgáltak. Gondoskodtunk arról, hogy a bázisok eloszlása a lehető legközelebb legyen a kapcsolódó hármas hélix oligonukleotidokhoz. A btfo13cu hármas hélix oligonukleotidhoz, amely csak párhuzamos orientációban képes kötődni, kontrollként fordított szekvenciájú oligonukleotidot terveztek (3 és 5 véget cseréltek). Az inverz oligonukleotidok ugyanazon összetétel mellett a bázisok megoszlásával is azonosak. Inv-vel jelölték őket (fordítottra). Arra is ügyeltek, hogy a kontroll oligonukleotidok módosításai megegyezzenek a hármas helix oligonukleotidokéival. A hármas helix oligonukleotidokhoz hasonlóan biztosították, hogy a kontroll oligonukleotidok ne legyenek képesek hibridizálódni az ICAM-1 mRNS-sel (antiszensz hatások). Az összes kontroll oligonukleotid és a megfelelő hármas hélix oligonukleotid szekvenciáját, amelyhez használták, az anyagok részben mutatjuk be (1.7.1. Szakasz, 27. oldal). 62 találat
Ha a TFO17GA-t a pg4h1 plazmiddal inkubáltuk (káliummentes) inkubációs pufferben, és besugároztuk, akkor a hármas hélix oligonukleotid 100-szoros moláris feleslegéből kimutatható volt a PCR-reakció gátlása. A TFO mennyiségének további növekedése nem eredményezett nagyobb gátlást. Meg kell jegyezni, hogy a PCR-reakció csak akkor akadályozható meg, ha mindkét DNS-szál keresztkötött (bisaduktus), mivel monoadduktumok esetében a PCR-amplifikáció ellenkező szála továbbra is elérhető. A reakcióelegy teljes PCR-gátlása ezért valószínűtlen. Ha az inkubálás káliumtartalmú pufferben történt, hasonló eredményeket figyeltünk meg, a gátlás csak 1000-szeres TFO-feleslegből volt kimutatható. Ez az eredmény egybeesik a csökkent hármas hélix képződéssel a gél retardációs kísérletekben kálium jelenlétében. Sugárzás nélkül a PCR reakciót nem gátoltuk. A plazmid-sávok összehasonlítása azt mutatta, hogy az alkalmazott plazmid mennyisége minden tételben megközelítőleg azonos volt, és hogy a PCR-termék mennyiségének különbségei a PCR-gátláson alapulnak, és nem az alkalmazott plazmid különböző mennyiségén. 80 találat
4.1.3 Az ICAM-1 gátlása btfo13cu-val Miután az ICAM-1 expressziót gátoltuk a TFO13GT antiparallel kötő hármas hélix oligonukleotiddal, kísérleteket végeztünk a párhuzamosan kötődő btfo13cu-val. Ennek az oligonukleotidnak gátló hatása volt az ICAM-1-re is (47. ábra). ICAM-1 HLA-DR A kezeletlen E kezeletlen B IFNγ F IFNγ C btfo13cu G btfo13cu D bcoinvcu H bcoinvcu 47. ábra: HLA-DR expresszió és az A431 sejtek ICAM-1 expressziója btfo13cu transzfekció után. Bal oldalon a FITC-jelölt anti-ICAM-1 antitesttel történő festést mutatjuk be, jobb oldalon a PE-konjugált anti-HLA-DR antitest festését. A sejteket vagy nem kezeltük (47. A és E ábra), IFNy-vel kezeltük (47. B és F ábra), vagy az IFNy-kezelés előtt transzfektáltuk 2 µm btfo13cu-val (47. C és G ábra) vagy 2 µm bcoinvcu-val (47. D és H ábra). volt. 86 találat