Az NLRC5 kiütötte az egeret a gyulladás különböző modelljeiben a vita során

I. Belgyógyászati ​​Klinika (igazgató: Prof. Dr. Stefan Schreiber) a Schleswig-Holsteini Egyetem Orvosi Központjában, a Kieli Christian Albrechts Egyetem Campus Kielében. AZ NLRC5 KIEGÉSZÍTŐ EGYSÉG FONTOSSÁGA AZ ÉRINTETT IMMUN RENDSZER EGYÉB GYULLADÁSI MODELLEINEK orvostudományi disszertációja A Christian-Albrechts-Universität zu Kiel karának előadója: NICOLINA LARA BÖTTCHER, Kiel Kiel 2012

egeret

1. Előadó: Prof. Dr. Rosenstiel 2. riporter: Prof. Dr. A szóbeli vizsga Grassl napja: 2013. december 18. Nyomtatásra jóváhagyva, Kiel, 2013. november 13. aláírta Prof. Dr. Laudes

Ezennel kijelentem, hogy az Nlrc5 kiütő egér jelentősége a veleszületett immunrendszer különböző gyulladásos modelljeiben című doktori értekezés, eltekintve doktori témavezetőmtől és más akadémiai tanáraimtól, formai és tartalmi szempontból saját munkám, és ez a A munkában felsorolt ​​egyéb segédeszközöket nem használtam. Az összes szó szerinti vagy tartalommal kapcsolatos részt ilyennek jelöltem meg. Azt is megerősítem, hogy csak a mellékelt disszertációt nyújtottam be ebben és semmilyen más doktori eljárásban, és hogy ezt a doktori eljárást nem előzte meg végül kudarcot valló doktori eljárás. Hely, dátum, aláírás

i Tartalomjegyzék Rövidítések és kifejezések listája technici. iii Az ábrák felsorolása. v Táblázatok listája. v 1 bevezetés. 1 1.1 Gyulladásos bélbetegség. 1 1.2 Genetikai asszociációs vizsgálatok a krónikus gyulladásos betegségek területén. 3 1.3 Autoinflammatorikus betegségek. 4 1.4 A veleszületett immunrendszer és a mintafelismerő receptor. 5 1.4.1 A Nod-szerű receptor család gén-asszociációi krónikus gyulladásos betegségekkel. 7 1.4.2 A Nod-szerű receptorcsalád. 8 1.5. 11 2 Anyag és módszerek. 13 2.1 Anyag. 13 2.2 Egerek. 13 2.3 Egérkísérletek. 14 2.3.1 Egerek előkészítése. 14 2.3.2 Endotoxin sokk. 14 2.3.3 DSS által kiváltott vastagbélgyulladás. 15 2.4 Az egérszövet/sejtek izolálása. 17 2.4.1 DNS-izolálás egérfarkakból. 17 2.4.2 Csontvelőből származó makrofágok (BMDM). 17 2.4.3 Tüdő. 19 2.4.4 Stimuláció. 19 2.5 Molekuláris biológiai módszerek. 20 2.5.1 RNS izolálás a szövetektől. 20 2.5.2 cdna szintézis. 21 2.5.3 Fordított transzkriptáz polimeráz láncreakció (RT-PCR). 21 2.5.4 Agaróz gél elektroforézis. 22 2.5.5 Valós idejű PCR. 23 2.5.6 ELISA. 23 2.6 Szövettani módszerek. 24 2.6.1 Előkészítés. 24 2.6.2 HE festés. 24 2.7 Statisztika. 25 3 eredmény. 26-án

ii 3,1 Nlrc5. 26 3.1.1 A rágcsáló Nlrc genomi szervezete5. 26 3.1.2. Az Nlrc5 expressziós profilja. 27 3.1.3. Az Nlrc5 interferon-y szabályozása. 27 3.2 A kiesés megerősítése. 28 3.3 Az Nlrc5-deletált egér alapfenotipizálása. 29 3.3.1 A bélszervek alapszövettana. 29 3.3.2 Laboratóriumi alapértékek. 32 3.4 Provokációs modellek. 33 3.4.1 Endotoxin-sokk. 33 3.4.2 LPS stimulálása in vitro. 35 3.4.3 Nátrium-dextrán-szulfát (DSS) által kiváltott vastagbélgyulladás. 36 4 Megbeszélés. 42 4.1 Az Nlrc5 törölt egér. 42 4.2 Az egér Nlrc5 expressziója és indukciója. 4.3 Az Nlrc5 deléciója véd az akut gyulladásos modellben. 4.4 Az Nlrc5-deletált egér súlyosbodott gyulladása DSS-indukálta colitisben. 47 4.5 Az Nlrc5 dichotóm hatása a különböző gyulladásos modellekben. 49 4.6 Kitekintés. 53 5 Összegzés. 55 Irodalomjegyzék. 56 Függelék Felhasznált anyagok. 61 Köszönetnyilvánítás. 63 önéletrajz. 64.

iv RIG RLR RNS Rpm RPMI-1640 RT-PCR sirna SD SEM Tab. TAE Taq TH TLR TMB TNF tubus kút WT Retinoinsavval indukálható gén Retinsav indukálható gén (RIG), mint receptor Ribonukleinsav, percenkénti forduló, Roswell Park Memorial Institute, specifikus sejttenyésztő táp Fordított transzkriptáz-polimeráz láncreakció Kis interferáló ribonukleinsav Szórás Az átlagos táblázat standard hibája Tris-Acetat-EDTA Termophilus aquaticus T-segítő sejt Toll-szerű receptor tetrametilbenzidin Tumor nekrózis faktor Műanyag reakcióedény A reakciólemezben Vad típusú egér vagy egér Mint általában Angol kifejezések dőlt betűvel ebben a munkában. A pontosabb megkülönböztetés érdekében a fehérjékkel ellentétben a géneket dőlt betűvel írják, az egérkomponenseknél pedig a kisbetűket, az embernél a nagybetűket használják. Ebben a munkában leginkább az Emberi Genomszervezet génnómenklatúra bizottságának nomenklatúráját használják 2008-tól. Kivételt képez a Nod-szerű receptor kifejezés, amelyet népszerűsége miatt a nukleotidkötő domén és a leucinban gazdag ismétlődést tartalmazó családra használnak.

Bevezetés 12 endotoxin sokkos tesztet hajtottak végre, amelyben az interleukin-1 játszik nagy szerepet. Másrészt a kísérleti vastagbélgyulladás komplex modelljét alkalmazták, amely magában foglalja mind akut fázist sebgyógyító mechanizmusokkal, mind krónikus fázist az adaptív immunválasz stimulálásával. Ebben a tézisben a következő kérdéseket vizsgáltuk: Módosítható-e egy akut vagy krónikus gyulladásos reakció in vivo az Nlrc5 genetikai hiányával? Hogyan befolyásolja az Nlrc5 deléciója a citokin választ az akut és krónikus gyulladásos válaszban? Hogyan befolyásolja az Nlrc5 szerkezeti hasonlósága a többi Nod-szerű receptorral, amelyek ismertek bizonyos betegségekhez való kapcsolódásukról, milyen szerepet játszanak a veleszületett immunrendszerben?

Anyag és módszerek 25 másodperc 70%, 80% és 90% izopropanol, majd 2 x 5 perc 100% izopropanol). Ezt követte 3 perc hylol, mint szerves oldószer, majd eukitt fedőlemezzel történő bevonása. 2.7 Statisztika Az adatokat a GraphPad Prism program, a GraphPas Software, La Jolla, USA segítségével értékeltük. Ezt a programot használták a grafikonok létrehozására.

Eredmények 30 vizsgált változás. A Langerhans-szigetek azonban változatlanul mutatkoztak meg. Ha az Nlrc5-deletált egerek kreatinin-értékét csökkentették, a veséket is alaposabban vizsgálták, a glomerulusok és a tubulusok változatlanok voltak. Összességében az Nlrc5-deletált egerek szövettanilag mutattak lényeges változásokat, a vad típusú egerek összehasonlító csoportjához viszonyítva.

Eredmények 31 lép Nlrc5 -/- egér vad típusú egér (C57BL/6) tüdő vastagbél nyirokcsomók vese hasnyálmirigy 7. ábra: Az Nlrc5 törölt egér és a vad típusú egér alapszövettana Az Nlrc5 törölt és vad típusú egerek szövettanilag a HE festés nem mutatott releváns különbségeket.

A 40. eredmény számít. A cdna feldolgozása után a kiválasztott citokinek expresszióját valós idejű PCR-rel mértük. 0,0024 relatív egységgel az interleukin-1β expressziója 1,7-szeresére nőtt az Nlrc5-deletált egerekben (vad típusú egerek: 0,0014). Az interleukin-18 (1,8-szoros), a KC (1,4-szeres) és az interferon-y (1,7-szeres) expresszióját szintén megtaláltuk az Nlrc5-deletált egerek vastagbélében, összehasonlítva a vad típusú egerek vastagbélével. Az egerek 30 napos DSS-vastagbélgyulladás után megnövekedtek. Ezzel szemben a TNF-a-t alacsonyan szabályozták. Az Nlrc5-deletált egerek 0,0006-os cdna-tartalma 0,6-szor alacsonyabbnak bizonyult, mint a vad típusú egereknél (0,0011) (15. ábra). Az interleukin-12 stabil expressziót mutatott.