Az oropharyngealis intratrachealis PAMP beadása és a bronchoalveoláris lavage alkalmazása

Összegzés

A gazda immunválasza a kórokozó fertőzésére szorosan szabályozott folyamat. Egerekben a lipopoliszacharid tüdő-expozíciós modell segítségével nagy felbontású értékelések végezhetők a betegség kialakulásával összefüggő komplex mechanizmusokról.

Absztrakt

Bevezetés

A leírt protokollok nagyon rugalmasak, és könnyen módosíthatók a PAMP-k széles skálájának és a molekuláris minták kapcsolódó (gyengített) károsodásának felmérésére. Ezenkívül néhány további módosítással ezek a protokollok alkalmazhatók olyan vizsgálatokban is, amelyek allergiás légzőszervi betegség progresszióját vagy gazdasejt-patogén kölcsönhatásokat mutatnak élő baktériumok, vírusok vagy gombák 5-10.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Jegyzőkönyv

Minden kutatást a Virginia Tech Intézményi Gondozási és Felhasználási Bizottságának (IACUC) jóváhagyásával és a laboratóriumi állatok gondozására és felhasználására vonatkozó Országos Egészségügyi Intézetek útmutatójának megfelelően hajtottak végre.

1. LPS intratracheális (ok) beoltása oropharyngealis beadással

2. Szérum- és bronchoalveoláris mosás (BAL)

900 μl a légcsőbe, felfújva a tüdőt, és azonnal kivonva a HBSS-t. Helyezze a hátsó BALF-ot egy 15 ml-es kúpos csőbe.

  • Ismételje meg ezt a lemosást még kétszer, hogy körülbelül 3 ml BALF-et gyűjtsön a későbbi elemzéshez. Tárolja a BALF-et jégen vagy 4 ° C-on használatig.

    • 3. Szövettani készítés

    1. Centrifugáljuk a 2.5 lépésben összegyűjtött teljes vért 12 000 xg-vel 5 percig a szérum izolálása céljából. A szérumot egy előre jelzett 1,5 ml-es mikrocentrifuga-csőben, és -80 ° C-on tároljuk
    2. Értékelje a szérum citokinszintjét ELISA vagy hasonló teszt segítségével. Hígítsuk a szérumot 1,05 és 1,20 között egy megfelelő hígító pufferben, a vizsgálattól függően, a gyártó utasításainak megfelelően. Ezeket a hígításokat a minták többségének futtatása előtt empirikusan meg kell határozni.
    3. A kapott kis szérummennyiség miatt csökkentse a minta térfogatát az ELISA lemezen, félig betöltve. Például a legtöbb kereskedelmi forgalomban levő ELISA-eljárás 100 µl térfogatú standardokat és mintákat használ. A minták mentése érdekében töltsön be 50 μl standardot és hígított szérumot lyukanként.
    4. Centrifugáljuk a BALF-ot egy hűtött pad tetején, centrifugáljuk 200 g-vel 5 percig. Töltsük át a sejtmentes felülúszót két előre jelzett 1,5 ml-es mikrocentrifuga csőbe, és -80 ° C-on tároljuk.
    5. Értékeljük a BALF citokineket ELISA vagy hasonló vizsgálattal hígítás nélkül.
    6. Fel nem használt szérum és BALF -80 ° C-on

    5. Differenciálfestés és BAL cellularitás értékelése

    6. Szövettani vizsgálat

    1. Készítse elő a tüdőt a hisztopatológiai értékeléshez. 24-48 órás formalin-rögzítés után az egész felfújt tüdő ventrálisan orientálódik és paraffinba ágyazódik. Vágja le a blokkokat, hogy felfedje a kapott fő áramlási útvonalakat.
    2. A pontozási pontosság javítása érdekében helyezze a tüdőt ugyanabba a helyzetbe, és vágja le az egyes blokkokat, ami a fő intrapulmonalis axiális légutak maximális hosszanti megjelenítését eredményezi. Innentől kezdve vágjon le 5 mikronos sorozatszakaszokat, és fesse meg hematoxilinnal és eozinnal (H&E). További szakaszok vághatók és készíthetők el in situ hibridizációhoz standard protokollok segítségével.
    3. A hisztopatológia értékelése félkvantitatív értékelési rendszer alkalmazásával, a következő gyulladásos paraméterek alapján, amelyek 0 (hiányzik) és 3 (súlyos) pontszámot kapnak: mononukleáris és polimorfonukleáris sejtinfiltráció; A légzőszervi hámsejtek sejtjeinek hiperpláziája és sérülése; Extravazáció; perivaszkuláris és peribroncheolar piszkok; és a gyulladással járó tüdő százalékos aránya. A tüdő hisztopatológiáját tapasztalt patológusnak kell értékelnie.
    4. Átlagolja az összes paraméterértéket, hogy átfogó hisztopatológiai pontszámot állítson elő, vagy egyedi pontszámokat használjon a betegség progressziójának specifikus aspektusainak számszerűsítésére. Minden pontozást kettős-vak módon végezzen, a bírálók megvakulnak mind a genotípus, mind a kezelés szempontjából. A pontozási rendszert korábban 6,7,10 írták le.

    Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

    Reprezentatív eredmények

    Az LPS beadása magas szintű helyi és szisztémás pro-gyulladásos mediátorokat indukál, beleértve a veleszületett immunválaszhoz kapcsolódó számos citokint. A BALF helyi citokinszintjét hagyományos technikákkal, például ELISA-val értékelik. Az LPS beadása után a tüdőben szabályozott citokinek közé tartoznak a TNF-α, IL-1β és IL-6 (2A. Ábra). A szisztémás citokinszintek a szérumban ugyanazon technikával, mint a BALF becslései (2 B) leírt, értékelt. Nem ritka, hogy néhány mediátor jelen van a helyi mikrokörnyezetben, de jelen van a szérumban. Például a TNF-α rutinszerűen magas szinten található a tüdőben az LPS után, de általában nem detektálható szisztémásan az ebben a protokollban leírt körülmények között (2A. Ábra és 2 B; a kimutatási határ alatt).

    pamp
    2. Az LPS légúti expozíciója fokozza a lokális és szisztémás citokinek szintjét. A) Az LPS expozíció után a BALF-ben az első 24 órán belül a proinflammatorikus citokinek széles skálájának lokális szintje figyelhető meg, beleértve a TNF-α-t, IL-1β-t és IL-6-ot. Ezek a citokinek ELISA-val értékelhetők, az itt bemutatott módon, 24 órával az LPS expozíció után. B) Számos citokin szisztémásan is kimutatható a szérumban. Van azonban néhány kivétel, köztük a TNF-α, amelyek magas koncentrációban találhatók meg a BALF-ben a szérumban, de nem. A szérumban érdeklő citokineket empirikusan értékelni kell a nagyszabású értékelés előtt. Kattintson ide a nagyításhoz .

    Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

    Vita

    Az egér tüdőben az immunválasz sikeres értékelésének legfontosabb lépései a következők: 1) válassza ki az értékelendő modellhez a megfelelő egér törzset és nemet; 2) a PAMP tüdőbe juttatásának optimalizálása; 3) a BALF megfelelő gyűjtése és feldolgozása; és 4) megfelelően rögzítse és előkészítse a tüdőt a hisztopatológiai felmérésekhez.

    Az oropharyngealis beadás pontosabbnak bizonyult, mint a gyógyszer tüdőbe juttatásának más formái Ennek oka nagyrészt a légutakhoz való közvetlen hozzáférés, valamint az orr- és maxilláris lerakódással kapcsolatos problémák megkerülése. Ugyanakkor, mint minden állatkísérlet esetében, ez is nagy kézi ismereteket és gyakorlatot igényel az irányítási ismeretek megszerzéséhez. A helytelen technika hatástalan tüdőt és egyes esetekben állatkárosodást okozhat. Általában az Evans Blue Dye (EBD) hatékonyan alkalmazható oktató eszközként ehhez az eljáráshoz, vagy a betét 4 esetleges problémáinak elhárításához. Az EBV beadható, majd formamiddal kivonható a szövetből. Az EBD mennyisége kiszámítható az abszorbanciaszintek segítségével, összehasonlítva a standard görbével. Kezünkben a tipikus EBD-helyreállítás 90-98% között mozog. Állítólag a fel nem szívódott festék nagy része a nyelőcső szivárgásával jár. Pontossága miatt az informatikai adminisztrációs technológia ideális különféle dózis-érzékeny anyagok tüdőbe juttatásához, például aktív gyógyszerészeti összetevők vagy fertőző organizmusok számára.

    t "> Ezt az eljárást úgy optimalizálták, hogy az LPS-t és más PAMP-kat az egerek tüdejébe juttassák. Miután ezeket a technikákat elsajátították, további vizsgálatok is elindíthatók módosított protokollokkal annak érdekében, hogy hatékonyan értékeljék a gazda-patogén kölcsönhatásokat az élő kórokozókkal. Hasonlóképpen itt A leírt technikák nagyon sokoldalúak, és bármilyen kísérleti célra felhasználhatók egy kísérleti vagy gyógyszerészeti szer klinikai és fiziológiai jelentőségének felmérésére. Az adagolás pontossága miatt ez a technika ideális az in vivo vizsgálatokhoz is, amelyek magas szintet igényelnek A finanszírozás pontossága.

    Ez az eljárás az LPS és más PAMP-k egerek tüdejébe juttatására van optimalizálva. Miután ezeket a technikákat elsajátították, további vizsgálatok is elindíthatók módosított protokollok felhasználásával, hogy hatékonyan értékeljék a gazda-patogén kölcsönhatásokat az élő kórokozókkal. Hasonlóképpen, az itt leírt technikák nagyon sokoldalúak és alkalmazhatók minden olyan vizsgálatra, amely egy kísérleti vagy gyógyszerészeti szer klinikai és fiziológiai relevanciájának felmérésében érdekelt. Az adagolás pontossága miatt erre a technikára szükség van azokban az in vivo vizsgálatokban is, amelyek nagy pontosságot igényelnek a hatóanyagok beadása során.

    Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

    Közzétételek

    A szerzők kijelentik, hogy nincsenek versengő pénzügyi érdekek.