Candida albicans vizualizálása az egér gyomor-bél traktusában fluoreszcens helyzetben
Összegzés
E protokoll célja a Candida albicans sejtek alakjának és lokalizációjának vizualizálása az emlősök gyomor-bél traktusában.
Absztrakt
A Candida albicans a bél mikrobiotájának gombás összetevője emberekben és sok más emlősben. Noha a C. albicans a legtöbb kolonizált gazdaszervezetben nem okoz tüneteket, a kommensális tartály a fertőző betegségek tárházaként szolgál, és a magas gombamell jelenléte a bélben gyulladásos bélbetegséggel jár. Itt leírunk egy módszert a C. albicans sejtek morfológiájának és lokalizációjának vizualizálására a stabil emésztőrendszeri kolonizáció egérmodelljében. A kolonizációt C. albicans egyetlen dózisával állapítják meg olyan állatoknál, akiket orális antibiotikumokkal kezeltek. A bélszövet szegmensei olyan módon kapcsolódnak, hogy megőrizzék a luminális tartalom (mikroorganizmusok és nyálka), valamint a gazda nyálkahártyájának felépítését. Végül fluoreszcens in situ hibridizációt hajtunk végre gomba rRNS elleni próbák segítségével a C. albicans és a hifák festésére. Ennek a protokollnak az egyik fő előnye, hogy lehetővé teszi a C. albicans sejtmorfológiájának és a gazda struktúrákkal való térbeli összefüggésének egyidejű megfigyelését a gyomor-bélrendszeri kolonizáció során.
Bevezetés
A Candida albicans egy gombás kommensál, valamint egy opportunista emberi kórokozó. Ennek az élesztőnek nincs meghatározott környezeti rése, ehelyett az emberek és más emlősök gyomor-bél traktusában, bőrében és genitourinary traktusában terjed 1. Míg a C. albicans korai kutatása elsősorban annak virulencia-potenciáljára összpontosított, számos újabb jelentés szerint az organizmusok bélben való elterjedése fontos szerepet játszhat a normális egészségben, ideértve a gazda immunfejlődését is. Az emlős bélben a C. albicans kommensalizmusának megkönnyítése érdekében kifejlesztettünk egy stabil GI-kolonizáció és egy fluoreszcencia in situ hibridizációs (FISH) egérmodellt a gombás élesztősejtek és hifák megjelenítésére a bél lumenében.
Ebben a cikkben részletes útmutatásokat nyújtunk az egerek gyomor-bél traktusának C. albicans jó minőségű kolonizációjának megállapításához, az eutanizált állatok emésztőrendszerének boncolásához, szövetrögzítéshez oly módon, hogy megmaradjon a luminalis a C kimutatására. albicans a gazdaszövetekben FISH alkalmazásával. A vad típusú és mutáns C. albicans törzsek mellett a szondázási technika alkalmazható más mikroorganizmusok leadására is. A rögzítési technika hasznos lehet minden olyan vizsgálatban, amelyben a béltartalom megőrzése kívánatos. A FISH eljárás egy nap alatt elvégezhető, és felhasználható több gombafaj felkutatására, különböző, különböző módon jelölt próbák segítségével.
Jegyzőkönyv
Az alábbiakban vázolt lépéseket az UCSF Intézményi Állattenyésztési és Felhasználási Bizottság (IACUC) hagyta jóvá.
1. Egerek gyomor-bélrendszeri kolonizációja C. albicans-szal szájon át történő szondázással
2. A gyomor-bél szövet előkészítése a szövettan számára
JEGYZET: A protokoll ezen szakaszát Johansson és Hansson 16 átdolgozta .
3. Újonnan tervezett szondák validálása
JEGYZET: A C. albicans szondák validálásának következő protokollját adaptálták Swidsinski és mtsai. 17. .
4. FISH festés a GI traktus szövetekben
Reprezentatív eredmények
A megadott utasításokat követve ennek a technikának az eredménye lesz a hasított sejtek fluoreszcens jelölése a gazda hámjában, a nyálkában és a C. albicans-ban a megszakadt gi szövetekben. A vad típusú Candida albicans sejteknek kerek, egysejtű élesztősejtként vagy erősen megnyúlt, néha elágazó, többsejtű hifaként kell megjelenniük (a sejtosztódás a hifáknál nem fog nyilvánvalóvá válni). A C. albicans mutánsok emellett kisebb és kissé hosszúkás "szürke" élesztőként vagy nagyobb és kissé megnyúlt "GUT" (gyomor-bélrendszer által kiváltott átmenet) vagy "átlátszatlan" élesztőként is megjelenhetnek.
1.ábra ábrázolja az orális szondázáshoz használt etetőtűt, valamint a kulcsfontosságú tűpozíciókat a szondázási eljárás során. 2. ábra a szervek disszekciójához és az egér gasztrointesztinális szegmenseinek megjelenéséhez használt tipikus beállítást biztosítja.
3. ábraPÉLDÁUL C. albicans-t ábrázolja az egerek vastagbélében, a C. albicans specifikus próbával festve (3. ábraE) vagy a panfunonális szonda (3. ábraF, G). A C. albicans vörös ezeken a képeken, a gazdasejt magjai kékek, a nyákréteg pedig zöld. Mind a kerek élesztő, mind a nagyon hosszúkás hifák (fehér nyílhegyek) a vastagbélben fordulnak elő. Felhívjuk figyelmét, hogy a panfungus szondával a szín világosabb. 3. ábraG a panfunonikus szondával festett ume6 mutáns ugyanabban a rekeszben. Az Ume6 egy transzkripciós faktort kódol, amely szükséges a hifák képződéséhez in vitro körülmények között 19. Érdekes módon a mutáns által in vitro körülmények között megjelenített lezárt élesztőfenotípust a bélben nem összegzik, ami arra utal, hogy egy redundáns faktort kell aktiválni a 12. gazdában. 4. ábra a vad típusú C. albicans előfordulását jelenti az egér gyomor-bél traktus különböző szegmenseiben, beleértve a gazda nyálkahártyájával szomszédos régiókat és a bél lumenjének központibb régióit.