Értekezés. az agrármérnök doktor (Dr. agr.) megszerzéséhez Peter Škufca diplomás agrármérnöktől

1 A Martin Luther Egyetem Halle-Wittenberg Egyetem Agrártudományi Karának Táplálkozástudományi Intézetétől (igazgató: Prof. Dr. habil K. Eder) (dékán: Prof. Dr. agr. Habil W. Merbach) kísérleti tanulmányok az oxidált zsírok hatásáról A pajzsmirigyhormon és a lipidanyagcsere kiválasztott paramétereiről az állat patkány modellben Értekezés Peter Škufca diplomázott agrármérnök doktori Agriculturarum (Dr. agr.) megszerzéséhez urna: nbn: de: gbv: [Halle/Saale 2002

2 A Táplálkozástudományi Intézetből Kísérleti vizsgálatok az oxidált zsírok hatásáról a pajzsmirigyhormon és a lipidanyagcsere kiválasztott paramétereire a mintaállat patkányban A Martin Luther Egyetem Mezőgazdasági Kara Halle-Wittenberg disszertációként aiploma doktori fokozat megszerzéséhez (Dr. agr.) Peter Škufca diplomás agrármérnök mutatja be, született 1971. június 6-án, Ljubljanában, Szlovénia Lektor: 1. Prof. Dr. habil Eder 2. PD Dr. habil Brandsch 3. Prof. Dr. habil Jareis Dean: Prof. Dr. agr. habil. W. Merbach védelme 2002. július 1-jén Halle/Saale 2002

3 Tartalom-jegyzék Táblázatok Ábra-lista Az alkalmazott rövidítések listája Oldal I III IV 1 Bevezetés 1 2 Anyag és módszerek Teszt felépítés Az oxidált zsírok különböző szelénellátottságú lipid- és pajzsmirigyhormon-anyagcserére gyakorolt hatásának vizsgálata Az étrend összetétele Elemzési paraméterek Vizsgálatok az oxidált zsírok 9 pajzsmirigyhormonra gyakorolt hatásáról és lipid anyagcsere különböző jódellátással Az étrend összetétele Elemzési paraméterek Vizsgálatok a különböző hőkezelt 13 zsírok hatására a különböző E-vitamin tartalmú pajzsmirigyhormonok koncentrációjára Májhomogenát és májcytosol extrakciója Analitikai módszerek Az Absc zsírmutatóinak meghatározása A zsírok 20 fokú oxidációjának becslése. Peroxidszám 20. savszám

9 III Ábra-lista Ábra-lista Ábra Tartalom sz. (1992) 32 3 A glutation-peroxidáz aktivitásának közvetett meghatározásának elve 33 4 PCR-termékek elválasztása agarózgél-elektroforézissel 50 5 Pajzsmirigy-tüszők keresztmetszetében 57 6 Az oxidált zsírok hatásmechanizmusai a pajzsmirigyhormon szintézis hipotézisén 81

16 5 2 Anyag és módszerek 4,4% (w/w). A vizsgálati zsírok különböző zsírsavösszetételének hatásainak kiküszöbölése érdekében a friss napraforgóolaj zsírsavösszetételét 20% zsír hozzáadásával illesztettük az oxidált zsír zsírsavmintázatához. A linolsav (18: 2 n-6) volt az orientációs érték (54,1 g/100 g zsírsav) (1. táblázat). 1. táblázat: Az első kísérletben felhasznált zsírok jellemzése Kiinduló zsírok Napraforgóolaj Sertészsír Tesztzsírok Frissen oxidált Zsírforrás [g/kg diéta] Napraforgóolaj Sertészsír Kezelési hőmérséklet [C] Idő [hét] Zsírszámok Peroxidszám [meq O 2/kg zsír] 2,00-4, TBARS [µmol/kg zsír] 0,29-0,27 0,34 savszám [mg KOH/g zsír] 0,55-0,57 1,44 zsírsavösszetétel [g/100 g zsírsav] mirisztinsav (14: 0) 0, 1 1,6 0,4 0,1 palmitinsav (16: 0) 6,3 26,7 10,6 7,4 palmitoleinsav (16: 1) 0,1 2,3 0,5 0,1 0,1 sztearinsav (18: 0) 4,0 16,8 6,7 4,7 oleinsav (18: 1) 22,0 38,5 25,4 26,4 linolsav (18: 2 n-6) 65,8 9,3 54, 1 54,1 arachidsav (20: 0) 0,3 0,0 0,2 0,3 eikozénsav (20: 1) 0,3 0,8 0,4 0,3 tokoferol [mg/kg zsír] α-tokoferol, all-rac-α-tokoferol-acetát (megengedett) α-tokoferol-egyenérték [mg/kg], rövidítések: KOH, kálium-hidroxid; TBARS, tiobarbitursav-reaktív anyagok.

21 10 2 Anyag és módszerek 6. táblázat: A második kísérletben használt zsírok jellemzése Kiinduló zsírok Tesztzsírok Napraforgóolaj Pálmaolaj Frissen oxidált Zsírforrás [g/kg étrend] Napraforgóolaj Pálmaolaj Kezelési hőmérséklet [C] Idő [hét] Zsírszámok Peroxidszám [meq O 2/kg] 2, 0-4, TBARS [µmol/kg] 0,29-0,27 0,34 savszám 0,59-0,61 1,30 zsírsavösszetétel [g/100 g zsírsav] mirisztinsav (14: 0) 0,1 1, 2 0,2 0,1 palmitinsav (16: 0) 6,3 45,9 10,5 7,4 palmitoleinsav (16: 1) 0,1 0,2 0,1 0,1 sztearinsav (18: 0) 4,4 4,5 4,4 4,7 Oleinsav (18: 1) 22,4 37,7 24,3 26,9 Linolsav (18: 2 n-6) 66,2 9,5 59,8 60, 1 Arachidinsav (20: 0) 0,3 0,4 0,3 0,3 Eikozénsav (20: 1) 0,2 0,2 0,2 0,3 Tokoferolok [mg/kg zsír] α-tokoferol, all- rac-α-tokoferol-acetát (kiegészítés) α-tokoferol-egyenérték [mg/kg], rövidítések: TBARS, tiobarbitursav-reaktív anyagok.

25 14 2 Anyag és módszerek 10. táblázat: A harmadik kísérletben felhasznált zsírok jellemzése Kiinduló zsír Tesztzsírok FF 1. számú zsír 2. zsír 3. zsírforrás [g/kg étrend] Napraforgóolaj Sertészsír kezelési hőmérséklet [C] Idő [óra] Peroxidációs termékek zsírban Peroxidszám [meq O 2/kg] 1,6 1,5 TBARS [µmol/kg] 0,08 0,13 10,3 2,18 0,29 zsírsavösszetétel [g/100 g zsírsav] mirisztinsav (14: 0) 0, 8 1,1 0,9 1,0 0,9 palmitinsav (16: 0) 15,2 13,2 17,4 17,8 17,5 palmitoleinsav (16: 1) 1,5 1,3 1,6 1,6 1,5 sztearinsav (18: 0) 8,7 11,5 9,8 10,4 10,2 oleinsav (18: 1) 33,4 35,6 36,9 35,6 34,7 linolsav ( 18: 2 n-6) 36,6 26,1 26,9 26,6 27,2 linolénsav (18: 3 n-3) 0,5 0,6 0,3 0,3 0,3 eikozénsav (20: 1) 0,7 0,8 0,7 0,7 0,8 Tokoferolok [mg/kg zsír] α-tokoferol (elemezve), 9 all-rac-α-tokoferol-acetát Alacsony kiegészítés - 71, Megnövelt α-tokoferol-egyenérték [ mg/kg zsír] (számítva) Alacsony ráhagyás Megnövelt juttatás Rövidítések: FF, Friss zsír; 1. zsír, 50 ° C-on melegített zsír; 2. zsír, 105 C-on melegített zsír; 3. zsír, 190 ° C-on melegített zsír; TBARS, tiobarbitursav-reaktív anyagok.

27 16 2 Anyag és módszerek 11. táblázat: Az étrend összetétele a harmadik kísérletben Zsírkomponens friss Összetétel [g/kg] oxidált mennyiség [g/kg] Kazeinkeményítő Szacharóz Friss zsír: Napraforgóolaj Sertészsír * 50 * Cellulóz Vitamin premix Ásványi előkeverék DL-metionin 2 2 * napraforgóolaj- és zsírsavtartalom oxidált zsírokhoz (1. zsír, 2. zsír és 3. zsír). 1 vitamin-előkeverék/kg étrend: 4000 NE retinol; 1000 NE kolekalciferol; 0,75 mg menadion-nátrium-hidrogén-szulfid; 5 mg tiamin-hidroklorid; 6 mg riboflavin; 6 mg piridoxin-hidroklorid; 15 mg Ca-D pantotenát; 30 mg nikotinsav; 2,0 mg folsav; 0,025 mg kobalamin; 0,2 mg biotin; 1000 mg kolin-klorid, 16,9 g erősségű. 2 ásványi előkeverék/kg étrend: 9,83 g kalcium-karbonát; 9,42 g di-kalcium-foszfát; 4,87 gramm magnézium-foszfát; 10,0 gramm kálium-szulfát; 0,87 g magnézium-oxid; 2,99 g nátrium-klorid; 0,16 g vas-szulfát; 50,6 mg cink-oxid; 30,0 mg réz-szulfát-pentahidrát; 24,2 mg mangán-oxid; 0,32 mg kalcium-jodát; 0,33 mg nátrium-szelenit, 1,8 g szacharóz.

28 17 2 Anyag és módszerek 12. táblázat: Az alkalmazott étrendek α-tokoferol-koncentrációi és a tesztcsoportok besorolása a harmadik vizsgálati csoportba Zsír típusa α-tokoferol-acetát α-tokoferol E-vitamin Rövidített elemzési elemzés Csoport [mg/kg diéta] [mg/kg étrend] I II friss nincs 11,6 ± 0,95 25 FF/NE (25 mg/kg étrend) ± 38,1 250 FF/EE III oxidálódott 25 46,5 ± 2,21 25 OF # 1/NE IV 50 C ± 30, 4 250 OF # 1/EE V oxidált 25 25,4 ± 4,17 25 OF 2/NE VI hőmérsékleten 105 C ± 40,5 250 OF # 2/EE VII oxidálódott 25 26,7 ± 1,64 25 OF # 3/NE a VIII-on 190 C ± 7, OF # 3/EE Rövidítések: FF, friss zsír; OF # 1, 50 C-on melegített zsír; OF # 2, 105 C-on melegített zsír; OF # 3, 190 C-on melegített zsír; EE, fokozott E-vitamin-ellátás; NE, alacsony E-vitamin-ellátás. 13. táblázat: A diétás zsírok zsírértékei a harmadik kísérletben a kész étrend részeként POZ csoport [meq O 2/kg zsír] TBARS [mmol/kg zsír] I 4,66 0,02 II 4,41 0,00 III, 7 IV, 1 V 329 2,21 VI 224 2,26 VII 39,2 0,15 VIII 37,7 0,21 Rövidítések: POZ, peroxidszám; TBARS, tiobarbitursav-reaktív anyagok.

32 21 2 Anyag és módszerek A savszám kiszámítása: AN (mg KOH/g) = 56,1. KOH fogyasztás (ml). Koncentráció KOH (N) Zsír tömege (g) Tiobarbitursavval reakcióképes anyagok A TBARS meghatározása Sidwell és mtsai. Halliwell és Gutteridge (1989) és Valenzuela (1991) módosított. Ez a meghatározás két tiobarbitursav (TBA) és egy malondialdehid (MDA) molekula reakcióján alapul hő hatására savas környezetben (1. ábra). OH CHO O OH N 2 x + CH2 HN NH HS N OH CHO SN OH O NH S TBA MDA 1. ábra: Malondialdehid reakciója tiobarbitursavval (Valenzuela, 1991 szerint) A TBARS mennyiségének meghatározásához kalibrációs görbe 1.1-vel, 3,3-tetraetoxi-propán (TEP) standardként létrehozva. 0,2 g zsírt vagy 0,2 ml standardot összekevertünk 4 ml kloroformmal és 4 ml TBA reagenssel (0,67% (w/v) desztillált vízben, 1: 2 arányú jégecettel hígítva) és 4 percig rázattuk. A fázisok szétválása után a felső vizes fázist pipettázzuk és 95 ° C-on 30 percig melegítjük. Az abszorpciót ezután 532 nm-en mértük üveg küvettákban. A TBARS mennyiségét µmol-ban egy kalibrációs görbe segítségével határoztuk meg, és 1 kg zsírra vonatkoztattuk.

36 25 2 Anyag és módszerek A tüsző átmérőjét és a hám magasságát ezután digitalizált képeken mértük, amelyeket Sony 3CCD színes videokamerával rögzítettünk az Axioscope-on 200-szoros nagyítással (Zeiss, Jena, Németország). Objektívenként 30 tüszőátmérőt és három kapcsolódó hámsejt magasságát mértük (Seffner és Heller, 1979; Seffner, 1982). Az értékelést a KS értékelési program (Zeiss, Jena, Németország) felhasználásával hajtották végre. 14. táblázat: Beágyazási séma a beágyazó gépbe Beágyazási szakaszok Beágyazási idő (óra) 1 Etanol 70% I 1 2 Etanol 70% II 1 3 Etanol 80% 1 4 Etanol 90% 1 5 Etanol 96% I 1 6 Etanol 96% II 1 7 Etanol absz. I 1 8 etanol absz. II 1 9 Xilol I 1 10 Xilol II 1 11 Paraffin I 2 12 Paraffin II Legalább 1 15. táblázat: A beágyazószer eltávolítása Eltávolítási lépés Eltávolítás időtartama (perc) 1. Xilol II A paraffin eltávolítása 5 2. Xilol II A paraffintartalmú xilol eltávolítása 5 3. Xilol III Az utolsó paraffinnyomok eltávolítása 5 4. Xilol: Etanol abs. 1: 1 (v/v) a xilol eltávolítása 1 5. Etanol abs. I A xilol eltávolítása 5 6. Etanol absz. II. A xilol-maradékok eliminálása 5 7. Etanol absz. III. A xilol-maradékok eltávolítása 5 8. Etanol 96% 1 9. Etanol 80% víz (ioncserélt) Többször cserélni 5

40 29 2 Anyagok és módszerek Pajzsmirigy-peroxidáz A reakció paramétereit a 18. táblázat mutatja. 18. táblázat: RT-PCR paraméterek a pajzsmirigy-peroxidáz mrna és primer pár szekvenciákhoz TPO (EMBL ID: RNTPO) Primer 1 5 CCA CAA AAG GCC GAG GTT CAA G 3 Primer 2 5 AAG GGC TGT GGC ATT TAT TCG TCT 3 Primer koncentráció cdna szintézis To Go TM RT-PCR gyöngyök, Amersham Pharmacia) GAPDH (EBMI ID: RNGAPDHR) alapozó 1 5 GCA TGG CCT TCC GTG TTC C 3 Primer 2 5 GGG TGG TCC AGG GTT TCT TAC TC 3 TPO - 1,0 pmol/µl alapozó pár keverék GAPDH - 1,0 pmol/µl primerpár keverék 34 µl RNS-mentes, ultrapuha víz 1 µl Oligo pd (T) (12-18) (0,5 µg/µl) 5 µl RNS-minta (0,2 µg/µl) A tételeket összekevertük és a cdnát 25 perc alatt 42 ° C-on szintetizáltuk. Ezután a cdnát 95 ° C-on 4,5 percig denaturáltuk. PCR reakció (Pharmacia) (Redy To Go TM RT-PCR gyöngyök, Amersham Pharmacia) 40 µl denaturált reakcióelegy (cdna szintézis) 5 µl TPO primer páros keverék 5 µl GAPDH primer pár keverék A keverékeket összekevertük és 42 ciklus alatt végeztük (95 C, 30 sec Denaturálást végeztünk; 60 ° C, 30 mp alapozó rögzítés; 72 ° C, 45 mp. Alapozó amplifikáció). Rövidítések: GAPDH, glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenáz; TPO, pajzsmirigy-peroxidáz; EMBL ID, az mrna szekvencia azonosító száma az Európai Molekuláris Biológiai Laboratóriumban.

43 32 2 Anyag és módszerek Az antioxidatív védelmi rendszer paraméterei Az antioxidáns védelmi rendszer paramétereként az a-tokoferol koncentrációját határoztuk meg a plazmában és a májban. A késleltetési időt az LDL oxidációs érzékenységének paramétereként határoztuk meg. Ezenkívül meghatároztuk a máj szérumtartalmú szeléntartalmú GSH-Px aktivitását a máj citoszoljában, valamint a szuperoxid-diszmutáz (SOD) aktivitását az eritrocitákban. tokoferolok Balz és mtsai. (1993) és Coors (1991) meghatározta (lásd a 2.3.2. Fejezetet) Kis sűrűségű lipoproteinek oxidációs érzékenysége Az LDL oxidációs érzékenységét késleltetési időként határozták meg Esterbauer et al. (1989) meghatározott. A késleltetési idő a mérés kezdőpontja és a kezdeti abszorpció egyenesének (a) és az (b) érintő metszéspontja közötti intervallum (perc) az abszorpciós görbe lineáris növekedésének tartományában (Kleinveld et al., 1992) ( 2. ábra). 1,0 Abszorbancia 234 nm-en 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 Lag-idő [perc] 2. ábra: A késleltetési idő meghatározása Kleinveld és mtsai. (1992)

49 38 2 Anyag és módszerek megkezdődtek. Az összes vizsgálati táptalajt 25 ° C-ra melegítettük a meghatározás előtt, majd az extinkció növekedését 339 nm-en és 25 ° C-on 1 percig mértük egy spektrométeren (Pharmacia Biotech, Freiburg, Németország). A vakértéket a mintaértékek korrigálására használtuk, a NADPH/H + nem specifikus képződését malonil-CoA hozzáadása nélkül határoztuk meg, és kivontuk a minta értékéből. Az FsS-aktivitást a májban lévő lipogén enzimek relatív mrna-koncentrációjának meghatározása című fejezetben leírt egyenlet felhasználásával számítottuk. Az összes RNS-t guanidinium-tiocianát módszerrel határoztuk meg Chirgwin és mtsai. (1979) Chomaczynski és Sacchi (1987) után RNAzol B reagenssel (WAK Chemie Medical, Bad Soden, Németország) módosítva izoláltuk. A G6PDH, FsS és GAPDH primereket Köhler (1995) módszere alapján határoztuk meg, és elvégeztük a kinetikai vizsgálatokat (lásd a fejezetet).