Evolúciós változások a redox-aktív aminosavak használatában és azok okai - PDF Free
Evolúciós változások a redox-aktív aminosavak használatában és azok okai Evolúciós változékonyság a redox-aktív aminosavak használatában: okai és következményei 1978. december 20-án Rodalben ad Rodalb Mainz, 2014
Dékán: 1. bíráló: 2. bíráló: A szóbeli vizsga napja: 2015.06.03
Tartalomjegyzék Rövidítések listája. IV 1 Bevezetés. 1 1.1 Oxidatív stressz. 1 1.2 Mitokondria. 1 1.2.1 Felépítés és működés. 2 1.2.2 Mitokondriális légzési lánc és oxidatív foszforiláció. 4 1.2.3 Eltérések az univerzális genetikai kódtól. 11 1.3 Az öregedés szabadgyökök elmélete. 12 1.3.1 Reaktív oxigénfajok. 12 1.3.2 Az öregedés mitokondriális szabadgyökelmélete. 14 2 Kérdések és célok. 17 3 anyag. 18 3.1 Fehérjeadat-nyilvántartások. 18 3.1.1 A vizsgált állatfajok élettartama, testtömege és fehérjeszekvenciája. 18 3.1.2 Az egyes rekeszek humán fehérjeszekvenciái. 20 3.1.3 A légzési lánc komplexek nukleáris és mitokondriálisan kódolt alegységei. 21 3.2 Számítógépes programok és szoftvercsomagok. 21 3.3 Speciális vegyszerek. 21 3.4 Eszközlista. 22 3.5 Sejtkultúra. 23 3.5.1 Klonális sejtek. 23 3.5.2 Elsődleges sejtek. 23 3.6 Táptalajok és oldatok sejttenyésztéshez. 23 3.7 Megoldások biokémiai és sejtbiológiai vizsgálatokhoz. 24 3.8 Pufferek és oldatok a fehérje és a lipid elemzéséhez. 24 3.9 Antitestek. 27 4 Módszerek. 29 4.1 Bioinformatikai elemzések. 29 4.1.1 Az aminosavak fehérjeszekvenciákban való alkalmazásának gyakorisága. 29 4.1.2 A membránterületek azonosítása. 29 4.2 Sejtkultúra. 29 4.2.1 Az IMR90 sejtek sejtszámának meghatározása. 29 I.
Rövidítések listája 2SH Mercaptoethanol 4SH 1-Butántiol 8SH 1-Oktántiol 10SH 1-dekántiol 12SH 1-dodekántiolt 14SH 1-Tetradecanethiol 18SH 1-Octadecanethiol ABAM Mix Antibiotikum-Gombaellenes keverék Ammónium Ammonate, AChE Az acetilkolinészteráz AA Bosphoric Acid, ammónia, Acetylcholinic Acid Aosphine AAChE Az acetilkolinészteráz AA CAMA-deninic sav ATP, AcetylcholinesteraseA-CAMA, AChE, AcetylcholinesteraseAA-CAM, AChE, AcetylcholinesteraseA. kataláz CYS cisztein ddH2O kétszer desztillált vízben 3-merkapto-propionsav DHA dokozahexaénsav DMEM Dulbecco-féle módosított Eagle-közeg DMS Dodecylmethylsulfid DMSO dimetil-szulfoxid DNS dezoxiribonukleinsav DOH 1-dodekanol DPBS Dulbecco-féle foszfáttal pufferolt sóoldat CstF hasítási stimulációs faktor DTT ditiotreitol EDTA etilén-diamin-ER endoplazmatikus retikulum ETF elektrontranszfer gyűrű flavoprotein EtOH etanol FBS/FCS szarvasmarha/borjú magzati szérum, szarvasmarha magzati szérum FMN flavin mononukleotid GRáz glutation-reduktáz IV
GSH glutation GPX glutation-peroxidáz óra (órák), óra (s) H2O2 hidrogén-peroxid HRP torma-peroxidáz, torma-peroxidáz MAM mitokondriumokkal társult ER membrán MEM NEAA Minimum Essential Medium, Nem esszenciális aminosavak MTS mitochondrialis célzási sorrend M Molar perc ( mtdna Mitokondriális dezoxiribonukleinsav Msr metionin-szulfoxid-reduktáz MTT 3- (4,5-dimetil-tiazolil-2) -2,5-difeniltetrazolium-bromid MUFA (k) egyszeresen telítetlen zsírsav (ok), egyszeresen telítetlen zsírsav (ok), mm-en millimimolm mw milliwatt µ NADPH nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát NOX NADPH-oxidáz NaN3 nátrium-azid nm nanométer Oxa1 mitokondriális oxidáz-összeépítő fehérje 1 PAGE poliakrilamid gél elektroforézis PD populáció megduplázódik PUFA (k) többszörösen telítetlen zsírsav (ok), szobahőmérsékleten többszörösen telítetlen ribonukleinsav RT reaktív oxigénfajok, reaktív Sa ustoffspies SDS nátrium-dodecil-szulfát, nátrium-dodecil-szulfát SOD szuperoxid-diszmutáz SRP jelfelismerő V. részecske
t12sh terc-dodekántiol TBARS tiobarbitursav-reaktív anyagok, tiobarbitursav-reaktív anyagok TEMED N, N, N ', N'-tetrametil-etilén-diamin-TFA transz-zsírsavak, transz-zsírsavak TM transzmembrán TOC α-tokoferol, E-vitamin TOM transzlokáz a külső membrán transz-transz-transz-transz-transz-transz-transz-transzlokáz Tioredoxin TWEEN poliszorbát VDAC feszültségfüggő anioncsatorna VI
Bevezetés 5. ábra: A reaktív oxigén és nitrocsoportok reakcióinak áttekintése a mitokondriumban és következményei. Smith et al., 2003-ból adaptálva. A mitokondriális mátrixban a szuperoxid toxicitása mitokondriális Mn-SOD knockout egerekben tanulmányozható, amelyek csak antioxidánsok jelenlétében maradtak fenn 10 és 20 nap között (Lebovitz et al., 1996; Li és mtsai., 1995). Ezzel szemben a citoszolos Cu/Zn-SOD kiütése nem halálos, bár ezek az állatok kissé fokozott érzékenységet mutatnak a ROS iránt (Ho és mtsai., 1998), ami arra utal, hogy az extramitokondriális szuperoxid kevésbé mérgező. Az oxidáció által károsított fehérjék és lipidek egész életen át tartó felhalmozódásának jellemzője a lipofuscin szigorúan életkorfüggő előfordulása, a lipofil, aggregált fehérjék (30-58%) és a lipidek (1951%) nem lebontható tárolása postmitotikus sejtekben (Porta, 2002). A lipofuscin különösen erősen fordul elő a szívizomban és az idegsejtekben, valamint a retina pigment hámjában. Összefoglalva, az öregedés progresszív lefolyása ezen elmélet segítségével a következőképpen magyarázható: Az öregedés során az oxidált fehérjék folyamatosan felhalmozódnak. A 16 oxidációja
Anyag 5 ml piruvát (100 mm) 5 ml MEM NEAA (100 mm) 3.7 Biokémiai és sejtbiológiai vizsgálatok oldatai MTT oldat (3- (4,5-dimetil-tiazolil-2) -2,5-difeniltetrazolium-bromid oldat: 5 mg/ml MTT ddh2o-ban MTT szolubilizáló oldat: 40% (w/v) dimetilformamid 10% (w/v) nátrium-dodecil-szulfát, pH 4,0 (jégecet) 3,8 puffer és oldat fehérje- vagy lipidanalízishez: 1,37 M NaCl 27 mm KCl 100 mm Na2HPO4 x H2O 18 mm KH2PO4 ph 7,4 Foszfáttal pufferolt sóoldat TWEEN-20-mal (PBS-T): 1x PBS 0,05% (v/v) TWEEN-20 ph 7.4 Sejtgyűjtő puffer (lízispuffer) SDS nélkül: 24
Anyag 50 mm Tris-HCl 10% szacharóz 1 mm EDTA 1 mm EGTA 15 mm HEPES 1 mm nátrium-ortovanadát 1 mm NaF proteináz inhibitor 1: 100 (Sigma-Aldrich) foszfatáz inhibitor 1: 100 (Sigma-Aldrich) ph 6,8 4x betöltő puffer (Mintapuffer) SDS-PAGE-hoz: 200 mm Tris-HCl, ph 6,8 8% (w/v) SDS 40% (w/v) glicerin 0,02% (w/v) bromofenol kék 20% (v/t) v) β-merkaptoetanol 10-szer futó puffer SDS-PAGE-hoz: 250 mm Tris bázis 2,5 M glicin 1% (w/v) SDS ph 8,3 elválasztó gél SDS-PAGE-hoz: 0,375 M Tris-HCl, ph 8, 8 10% (w/v) akrilamid/biszakrilamid (29: 1) 0,1% (w/v) SDS 0,05% (v/v) TEMED 25
Anyag: 0,1% (w/v) APS rakó gél SDS-PAGE-hoz: 0,15 M Tris-HCl, pH 6,8 3% (w/v) akrilamid/biszakrilamid (29: 1) 0,1% ( w/v) SDS 0,05% (v/v) TEMED 0,1% (w/v) APS 10x transzferpuffer: 250 mm Tris bázis 2,5 M glicin 20% metanol hozzáadása 1x hígításhoz 1x Ponceau S: 0,2% (w/v) Ponceau S 5% (v/v) ecetsav blokkoló puffer: 5% (w/v) száraz tejpor (zsírmentes) PBS-T-ben Nem redukáló lipid puffer (gáztalanított): 20 mm TRIS, ph 7,4 1 mm MgCl2 5 mm KCl 26
Anyagpuffer zsírsavanalízishez: 1x PBS 10 µm fenotiazin 1 mm DTT 1 mm EDTA Luminol fejlesztő oldatok: A: 0,1 M Tris-HCl, pH 8,6 0,025% luminol B: 0,11% para-kumarinsav DMSO C-ban: 30% H2O2 TBARS assay Stop-oldat: 5% triklór-ecetsav 1 M jégecetben, 0,5% tiobarbitursav 10 mm NaOH-ban. 3.9 Antitestek Az alkalmazott antitesteket PBS-T-ben hígítottuk az alább megadott koncentrációkra. Ezenkívül az elsődleges antitesteket 0,05% nátrium-aziddal (NaN3) kezeltük. Antitestgyártó anti-hsp70 (1: 1000) stressz gén, USA anti-hsp90 (1: 1000) stressz gén, USA anti-p21 (1: 500) BD Biosciences, USA anti-p53 (1: 1000) Abcam, USA anti-p62 (1: 500) Santa Cruz Biotechnology, USA anti-poliubiquitin (1: 1000) Dako, Dánia tubulusellenes (1: 1000) Sigma-Aldrich, Németország 6. táblázat: Elsődleges antitestek 27
Anyagi antitestgyártó Esel anti-mouse-hrp (1: 10000) (Dianova) Jackson ImmunoResearch, USA Esel anti-rabbit-hrp (1: 10000) (Dianova) Jackson ImmunoResearch, USA 7. táblázat: Másodlagos antitest-HRP konjugátumok 28
Eredmények 7. ábra: A peroxiszomális és a sejtfehérjék közötti aminosav-eloszlás aránya 4 fajban (balról jobbra: Homo sapiens, Bos taurus, Mus musculus, Rattus norvegicus). 5.1.2 A mitokondriális és a celluláris fehérjék összehasonlítása A mitokondriálisan kódolt fehérjékben az aminosav-felhasználás arányát a celluláris fehérjékhez vagy a mitokondriálisan kódolt fehérjékhez viszonyítva a mitokondriálisan lokalizált fehérjékhez viszonyítva használtuk második és harmadik modellként (8. ábra és 9. ábra). A mitokondrium néhány sajátossága, hogy az oxidatív oxigénfajok fő termelőhelyének tekintik (Brand, 2010), és hogy az I komplex mitokondriálisan kódolt fehérjéiben a redox-aktív aminosav cisztein élettartamától függően kimerül (Schindeldecker et al., 2011), míg ez a redox-aktív metionin ott is dúsul, a maximális élettartamtól függetlenül (Bender et al., 2008). Ez a mitokondriumból kiemelkedő modellt alkot, amelyen tanulmányozni lehet az oxidatív stressz evolúciós alkalmazkodását és az ebből adódó differenciált aminosav-használat gyakoriságát. 39
Eredmények Használja a KLMNPQRSTVWY aerobicitást (V) 1,39 1,01 1,51 1,16 1,63 1,77 1,04 0,93 1,68 0,58 1,03 0,68 5E-05 6E-01 2E -06 1E-02 5E-09 9E-12 2E-01 5E-05 1E-09 3E-12 6E-01 2E-11 12. táblázat: V. modell: Az aminosavak gyakorisága a légzési lánc mitokondriálisan kódolt fehérjéiben szabadon élő, aerob és parazita, anaerob helminták. (egyirányú, nem parametrikus varianciaanalízis két kategóriával). * A ration kifejezés az átlagértékek arányát írja le. Ha összehasonlítjuk az aminosavak differenciált alkalmazását a légzési lánc mitokondriálisan kódolt fehérjéiben az aerob és az anaerob férgek között, akkor észrevehető, hogy a cisztein mutatja a legnagyobb átlagos változást a kimerülés formájában (12. táblázat). A legnagyobb szignifikanciát azonban a hisztidin mutatja, ami tehát az adatpontok alacsony szóródásának tudható be. A metionin alkalmazásának gyakorisága viszont magas szóródást mutat a vizsgált állatfajokon belül, ami magas átlageltéréssel együtt statisztikai szignifikanciát jelent. Mivel a valin aminosav diszperziója kicsi, ez a legjelentősebb változást eredményezi ebben a modellben. 49
Eredmények olyan oxidálható szubsztráton, amely gátolja vagy lassítja annak oxidációját (Halliwell, 1990). Meg kell jegyezni, hogy az oxidálható aminosavakon kívül cukor, DNS és lipidek is szolgálhatnak szubsztrátként. Különösen érdekes, hogy a metionin felhalmozódik a belső mitokondriális membrán fehérjéiben, amit biológiailag két metionin kodon jelenléte okoz a légzési lánc mitokondriálisan kódolt fehérjéiben. Feltételezték, hogy a metionin felhalmozódása ezekben a fehérjékben és a metionin kodon megduplázódása a mitokondriális DNS-ben ok-okozati oka a ROS termelődésének és fokozott előfordulásának ebben az organellában vagy kompartmentben (Bender et al ., 2008). Ezért érdekes volt megvizsgálni a metionin alkalmazását az emberi sejt különböző rekeszeiben vagy területein annak megállapítására, hogy megtalálható-e topológiailag specifikus gyakoriság ezen aminosav alkalmazásában. Ennek eredményeként a különböző szubcelluláris területekről származó humán fehérje szekvenciákat elemeztük metionintartalmuk szempontjából. 52
Eredmények 5.2.1 A metionin használatának összehasonlítása a különböző szubcelluláris területeken 10. ábra: A metionin alkalmazása humán fehérjékben különböző szubcelluláris területeken. Minden függőleges vonal egyetlen fehérjét szimbolizál, amelynek helyzete megegyezik a metionin használatának rangjával az alább látható eloszlási görbén. A zöld vonalak a megfelelő átlagot, a piros vonalak a metioninhasználat megfelelő mediánját jelentik a vizsgált rekeszekben. A folytonos függőleges vonal az összes vizsgált fehérje szekvencia középértékét jelöli 1980-ban. A 10. ábra a metionin statisztikai eloszlását mutatja az emberi fehérjékben a különböző szubcelluláris területeken. A következő rövidítéseket használtuk a 10. ábrán és a 14. táblázatban 53
Eredmények A négy légzési lánc-komplex (I, III, IV és V) összehasonlítása, amelyben az alegységek mind a magból, mind magából a mitokondriumból származnak, szintén eltérő gyakoriságot mutat a metionin használatban. Az I. komplex az összes vizsgált állatfajban átlagosan 5,84% metionint, egy Met kodonnal rendelkező állatokban 2,64% és két Met kodonnal rendelkező állatokban 6,82% metionint tartalmaz; A III. Komplex 3,79% metioninban, egy Met kodonnal 2,30% és két Met kodonnal 4,24% metionint tartalmazó állatokban. A IV komplex 4,72%, egy Met kodonnal 3,42% és két Met kodonnal 5,11% metionin esetén; V komplex minden állatfajban 5,31%, egy Met kodonnal 3,17% és két Met kodonnal 5,97% metionin esetén. A legnagyobb különbség a különféle komplexeken belül az I. komplexben figyelhető meg. Ennek eredményeként a metioninhasználat gyakorisága 4,18%, az egy Met kodonnal rendelkező állatok és a két Met kodonnal rendelkező állatok között. 60
Eredmények 12. ábra: A HT22 sejtek túlélési aránya 1 µm, 2 µm, 5 µm, 10 µm, 20 µm, 50 µm, 100 µm és 200 µm CAM, DES, CYS és GSH inkubálás után 72 órán keresztül (n> = 3). A 12. ábrán használt vízoldható CAM, DES, CYS és GSH anyagok nem mutatnak toxikus hatást a HT22 sejtekre a 72 órás inkubálás után alkalmazott koncentrációk egyikében sem. 13. ábra: A HT22 sejtek túlélési aránya 1 µm, 2 µm, 5 µm, 10 µm, 20 µm, 50 µm, 100 µm és 200 µm 2SH, 4SH, 8SH és 12SH inkubálás után 72 órán át (n> = 3). 72 órás HT22 sejtek 2SH, 4SH, 8SH és 12SH lipofil anyagokkal történő inkubálása után differenciált toxicitást találtak. A koncentráció növekedésével az összes anyag toxicitása növekszik. A toxikus hatás a 12SH, majd a 8SH, a 4SH és a 2SH esetében a legnyilvánvalóbb. A toxicitás tehát korrelál az alkillánc hosszával és a 62 koncentrációjával
Eredmények, a koncentráció nem befolyásolta a toxikus hatást. Csak a CAM mutatott alacsony koncentrációfüggő toxicitást 72 óra elteltével. 15. ábra: Az IMR90 sejtek (PD 28.1) sejttúlélése 72 µm inkubálás után 1 µm, 2 µm, 5 µm, 10 µm, 20 µm, 50 µm, 100 µm és 200 µm 2SH, 4SH és 8SH (n> = 3) ). Az IMR90 sejtek 72 órás, egyre lipofilebb 2SH, 4SH és 8SH anyagokkal történő kezelése után alacsony toxicitási szint is megfigyelhető volt (15. ábra). A három alkalmazott anyag egyikének sem volt egyértelmű dózisfüggő hatása. 16. ábra: Az IMR90 sejtek (PD 28.1) túlélési aránya 72 µm inkubálás után 1 µm, 2 µm, 5 µm, 10 µm, 20 µm, 50 µm, 100 µm és 200 µm 10SH, 12SH, 14SH (n> = 3) ). A 72 órán át 10SH, 12SH és 14SH kezeléssel kezelt IMR90 sejtek túlélési aránya 64-gyel nőtt