Fehérje kölcsönhatások felfedezése és a fehérje funkcióinak jellemzése a HaloTag technológia segítségével

Összegzés

A HaloTag technológia egy multifunkcionális technológia, amely jelentős sikert aratott a kis és nagy fehérje komplexek emlős sejtektől történő izolálásában. Itt kiemeljük ennek a technológiának az előnyeit a meglévő alternatívákkal szemben, és megmutatjuk, hogy mennyire hasznos a fehérje működésének számos aspektusának vizsgálata az eukarióta sejtekben.

Absztrakt

Bevezetés

A sejtfunkciók, az ingerekre adott válaszok, valamint a fejlődési és/vagy betegségállapotok változásainak megértése szorosan összefügg a proteom ezen különböző dinamikus állapotokban történő lehajlásával. Sokat tettek az alacsonyabb organizmusok proteomjának megértése érdekében, de tekintettel a fehérjék számára és az összes lehetséges kölcsönhatásra, ez nagyon kihívást jelent az emberi 1, 3–7 proteom kezelésében. A tömegspektrometria fejlődése nagyban lehetővé tette ezen vizsgálatok elvégzésének képességét, és itt további és jelentős előrelépést mutatunk be a HaloTag technológia fejlesztésében mind a fehérjekomplexek hatékony detektálása, mind az emlős sejtekből származó humán fehérjék funkcionális jellemzése céljából 8-10. Ez a technológia a közelmúltban számos tanulmányban kritikus tényezőnek bizonyult a fontos kölcsönhatások felfedezésében, lehetővé téve az új fehérje működésének betekintését és a betegség megértését. 11-13.

Itt mutatjuk be a két kulcsfontosságú terápiás fehérjére, a BRD4 fehérje-brómdomainra és a hiszton-dezacetilázra, a HDAC1 17 alkalmazott pulzáló és képalkotó protokollokat. Ezekkel a példákkal megmutattuk a partnerekkel való kölcsönhatást, ahogyan azt a tömegspektrometria elvárja, az enzimatikus aktivitás a HDAC1 komplex izolálása után és a sejtek helyes lokalizációja mindkét esetben. Ezek az eredmények együtt bizonyítják az eukarióta fehérje kölcsönhatások és funkciók jellemzésére szolgáló technika multifunkcionális jellegét és erősségét.

Jegyzőkönyv

Jegyzet: A következő protokoll használható bármely HaloTag Fusion készülékkel, és bármelyik választott sejtvonalban stabilan vagy átmenetileg transzfektált. Ezekhez a példákhoz a HaloTag fúziók HEK293T vagy HeLa sejtekbe történő átmeneti transzfekciójának protokolljait adjuk meg. Minden kísérlethez csak a kontroll fehérje használatát javasoljuk.

1. Fúziós fehérje expressziós teszt

3. Fluoreszcensen jelölt fúziós fehérjék sejtszintű képalkotása citoplazmatikus és nukleáris permeabilitású ligandum felhasználásával

1. Transzfekció, jelölés és képcellák:
   1. Minden egyes fúziós fehérje vagy kontroll 8 lyukú kamrájú fedőlemezében 400 μl HeLa-sejteket tegyünk a megfelelő táptalajba minden egyes üregbe 1-2 x 105 sejt/ml sűrűséggel.
   2. Inkubálja 18-24 órán át 37 ° C-on és 5% CO 2 -on, majd transzfektálja az ajánlások szerint.
   3. 18-24 órával a transzfekció után hígítsuk a TMR Ligandot 1: 200 arányban megfelelő sejtközegben, majd adjunk hozzá 100 μl oldatot mindegyik üreghez, és óvatosan keverjük össze.
   4. Inkubáljuk a ligandumokat tartalmazó transzfektált sejteket 15 percig 37 ° C-on és 5% CO 2 -on.
   5. Szívja be a tápközeg ligandumait, és cserélje ki 500 μl megfelelő táptalajra, amely hiányzó protein fúziós tag ligandumokat tartalmaz, amelyeket 37 ° C-ra melegítettek.
   6. Ismételje meg kétszer, összesen három mosásig.
   7. Helyezze a sejteket inkubátorba (376, C és 5% CO 2) 30 percre.
   8. A közeget szívja fel, és cserélje ki 500 μl 37 ° C-ra melegített megfelelő táptalajra
   9. Kép mikroszkópon megfelelő felvételi paraméterekkel (TMR gerjesztés: 555 nm, emisszió: 585 nm).

Reprezentatív eredmények

Bármely új fúziós fehérjével végzett munka során fontos, hogy először teszteljük a fehérje expresszióját a transzfekció után, és azt is megerősítsük, hogy megfelelő molekulatömegű fehérje termelődik. Mivel a HaloTag fúziós fehérjék fluoreszcensen és kovalensen jelölhetők permeabilis vagy a lokalizációtól függően át nem eresztő ligandumokkal, lehetővé válik a expresszió gyors meghatározása a sejtlizátumok denaturálásával gélelektroforézissel, majd fluorimaggerrel történő letapogatással. Az 1.2. Szakasz segítségével nyomtassa ki a megfigyelt Halo BRD4 (189 kD) és a kontroll HaloTag (Ctrl) (34 kD), 2A) leírt protokoll. Amint a protokollban említettük, a fúziós fehérjék expressziója detektálható hagyományos anti-HaloTag antitestekkel ellátott Western-blotokkal, vagy ha vannak, a csalifehérjével szembeni antitestekkel is. Ha lehetséges, ajánlott a fluoreszcens ligandum használata, mivel ez pontosabb, gyorsabb és könnyebb, mint az antitest detektálása, és kvantitatív is.

Az izolált komplexek aktivitása is vizsgálható; Javasoljuk a komplexek eluálását a TEV proteázzal (2.5. Protokoll szakasz), hogy megőrizzék a funkcionalitásukat. Ban ben 3A. Ábra A gyantából TEV proteáz alkalmazásával felszabaduló Halo-HDAC1 gél komplexek ezüstfestését mutatjuk be. TEV-proteázként a csali fehérje jelentős mennyisége, ebben az esetben a HDAC1, a fúziós fehérje Tag és fúziós partnere közötti összekötő területen figyelhető meg (3A. Ábra) megosztani. Annak megállapítására, hogy ez a frakció rendelkezik-e HDAC1 aktivitással, az eluált TEV mintákat HDAC-Glo 21 lumineszcens HDAC vizsgálattal teszteltük. Mint a 3B Amint az látható, a HDAC1 legördülő minták nagy aktivitású HDAC1-t mutattak (1. oszlop), amelyet specifikusan gátoltak egy ismert HDAC-gátlóval, a SAHA 22-vel (2. oszlop). A specifitás további bemutatására szolgáló kontrollokként nem figyeltünk meg HDAC-gátlást egy rokon család sirtuin-gátlójával, az EX-527 22-vel (3. oszlop), és egyetlen jelet sem észleltünk pusztán a pufferrel, amelyet a HDAC1 legördülő szonda nélkül adtunk (4. oszlop).

A funkcionális proteomika és a komplexek megértésének elengedhetetlen része a fehérje lokalizációjának és/vagy az emberkereskedelem megértése is. Mivel ugyanazok a fúziós konstrukciók fluoreszcensen jelölhetők a sejteken belül, konfokális képalkotással figyeltük meg lokalizációjukat. A 3. szakaszban leírtak szerint a HeLa sejtek átmenetivé váltak a Halo-BRD4 alkalmazásával (4A) és Halo-HDAC1 (4B) transzfektáltuk fluoreszcensen, a TMR ligandummal jelöltük és leképeztük. Mint a a 4A és 4B látható, a várt módon mind a sejtmagban lokalizálva 17. Ezek az adatok azt jelzik, hogy a tag jelenléte nem változtatja meg a fúziós partner fiziológiai sejt lokalizációját.

1. ábra: A fehérje lehajtható és konfokális képalkotó alkalmazások vázlata. Ingle konstrukcióként felhasználva számos alkalmazás lehetséges a fehérje működésének megértésére emlős sejtekben. Mindenki számára a halo-fúziós konstrukció stabilan vagy átmenetileg expresszálódik tapadó vagy szuszpenziós emlős sejtekben. A fehérje komplex lecsökkentése esetén a sejteket lizálják, a komplexeket kovalensen rögzítik a gyantán, és SDS-elúcióval (bal oldali sáv) vagy TEV-hasítással (jobb út) eluálják. Az SDS elúció ajánlott a tömegspektrometriás elemzés folytatásához, míg a TEV emésztés optimális a funkcionális elemzés elvégzéséhez. Az expresszió, a sejt lokalizáció, az emberkereskedelem vagy a fehérjeforgalom jellemzése érdekében az élő sejteket, a fúziós fehérjéket fluoreszcensen jelölik és tovább elemzik SDS-PAGE géleken vagy konfokális képalkotás segítségével. Mindkét celluláris vagy átlátszatlan fluoreszcens ligandum rendelkezésre áll, a fúziós fehérje lokalizációjától vagy reprezentációjától függően.

ild 2 "fo: content-width =" 6in "src ="/files/ftp_upload/51553/51553fig2highres.jpg "width =" 600 "/>2. ábra: Halo-BRD4 fehérje expresszió, lehúzás és tömegspektrometriás elemzés. (A) SDS-PAGE gélek, amelyek a Halo-BRD4 fúziós fehérje, 189 kD és önmagában a Halo-tag fúziós fehérje, 34 kD, kontroll (Ctrl) expresszióját mutatják be egy HEK293T sejtlizátumban TMR ligandummal (2.1. Protokoll szakasz). A géleket fluorimaggerrel szkenneltük a kimutatáshoz, és fluoreszcens molekulatömeg-markert használtunk. (B) Ezüstfestő gélek eluálódtak a Halo-BRD4 és Ctrl minták SDS-sel végzett biológiai replikátumaiból. A gélspektrumszámok (balra) és a normalizált spektrális bőségtényező-értékek (NSAF) (jobbra) molekulatömegméretei, amelyek a Halo biológiai replikátumok tömegspektrometriás elemzésében azonosított fehérjék fehérje molekulatömegét veszik figyelembe. (C) BRD4 és Ctrl. Megjelennek azok a fehérjék, amelyekről ismert, hogy kölcsönhatásba lépnek a BRD4-gyel, beleértve a pTEFb komponenseket (CDK9 és ciklin T) 18.20 és BRD9 19. Ezekből a fehérjékből nem azonosítottak peptideket a Ctrl.

3. ábra: Halo-HDAC1 komplex izoláció és aktivitás elemzés. (A) Ezüstfestő gélek, amelyek a Halo-HDAC1 komplexek és a háttér izolálását mutatják a Ctrl-től a TEV hasítása után (Protokoll 2.5. Szakasz). A kiemelkedő HDAC1 sáv (55 kDa) és a TEV proteáz sáv meg van jelölve. A szabad HDAC1-et TEV hasítással optimalizálták a HaloTag és a HDAC1 fúziós szekvencia közötti linkeren belül, miután a gyantára felvették (1. ábra). (B) A grafikon a HDAC1 komplex izolációs minták aktivitását mutatja egy lumineszcens hiszton-deacetiláz assay-ben, a HDAC által generált Glo 21-ben. A grafikon 1. oszlopa a HDAC-aktivitás magas szintjét mutatja a Halo-HDAC1 legördülő mintákkal (HDAC1). A 2. oszlop azt mutatja, hogy ez az aktivitás specifikusan csökkenthető a HDAC inhibitor, SAHA 22 hozzáadásával a lehúzható HDAC1 mintákhoz. Kontrollként a 3. oszlop egy, a sirtuin családra specifikus deacetiláz-inhibitort mutat be, de nem gátolja a HDAC-kat, az EX-527 22, nem gátolja a HDAC1 aktivitását, és a 4. oszlop, csak pufferrel nem figyelhető meg aktivitás.

4. Halo-BRD4 és Halo-HDAC1 konfokális képalkotás. A HeLa-sejtek élő sejt konfokális képalkotása Halo-BRD4 segítségével (A) vagy Halo-HDAC1 (B) transzfektáltuk TMR fluoreszcensen jelölt ligandumokkal. (A) A Halo-BRD4 expresszió a magra korlátozódik és (B) A Halo-HDAC1 kifejezések túlnyomórészt nukleárisak. A fluoreszcens csatorna panel bal oldala és a jobb oldali a fluoreszcens csatorna átfedése az egyes DIC csatornákkal. A képeket konfokális mikroszkóppal készítettük, amely 37 ° C + CO 2 klimatikus kamrával volt felszerelve, megfelelő szűrőkészlettel. Méretarány = 20 µm.

Vita

Miután a fúziós fehérjék készen állnak a legördülő kísérletekre, a protokoll maximális sikerének elérése érdekében nagyon fontos, hogy a lízis, a kötés és a mosás szakaszában kövessük az ajánlott időkereteket, mivel az egyik legnagyobb előny a komplex izolálás sebessége Folyamat. Ha ezeknek a lépéseknek bármelyikét meghosszabbítják, amint az egy antitestalapú detektálási eljáráshoz szükséges, fennáll a komplex disszociáció vagy a megnövekedett nem-specifikus kötődés veszélye. a sejtek nincsenek teljesen lizálva vagy hatékonyan befogva vagy befogva. Ha a mosások száma csökken vagy a kötés vagy a mosás során nem fordul elő a gyanta megfelelő keverése, akkor a nem specifikus fehérjék háttérszintje megnő. Ezenkívül a lízis eszköze nagyon fontos, mivel a gyanta iránti kötődési affinitáshoz kapcsolódik. Kísérletek a minták szonikálásához, az ajánlott mosószer eltávolításához, SDS vagy más erős detergens hozzáadásához és/vagy amelyet az AEBSF proteázinhibitor csökkenti, vagy a fúziós fehérjék és komplexeik gyantához való kötődésének elvesztését eredményezi.

Amint a bevezetőben említettük, a proteomika jelentős fejlődését a tömegspektrometria 1,7 jelentős előrelépése aktiválta. Ezért fontos kiemelni a tömegspektrometriás analízis megválasztásának fontos paramétereit annak érdekében, hogy dekonvolúcióba hozzuk a lehúzódó fehérjék keverékét. A műszereknek robusztusnak kell lenniük, és képesnek kell lenniük a kis mennyiségű, gyakran 23,24-nél kevesebb fehérjét tartalmazó minták rendszeres és hatékony elemzésére. A HaloTag technológiával egy multifunkcionális megközelítés alkalmazható, amely elősegíti a ProteomIC-vizsgálatokat, és jobban megérti a fehérjék funkcióját az emlős sejtekben.

Közzétételek

A cikk megjelenési költségeit a Promega Corporation szponzorálja. Danette L. Daniels, Jacqui Méndez, Hélène Benink, Andrew Niles, Nancy Murphy és Marjeta Urh a Promega Corporation alkalmazottai, a HaloTag technológia és alkalmazásai szabadalmainak kereskedelmi tulajdonosai. Michael Ford, Richard Jones, Ravi Amunugama és David Allen az MSBioworks, a jelen kéziratban leírt tömegspektrometriás szolgáltatások alkalmazottai.

Köszönetnyilvánítás

Köszönjük Dr. Martin Rosenberg, dr. Gary Tarpley és Dr. Keith Wood munkájának támogatásáért és Dr. James Cali, aki kritikusan olvasta a kéziratot. A DLD, JM, HB, NM, AN, JC és MU a Promega Corporation alkalmazottai. MF, RJ, RA és DA az MS Bioworks, LLC alkalmazottai.

---