Fehérjetisztítási technikák; News-Medical
Jogi nyilatkozat: Ez az oldal az oldal eredeti fordításának eredeti fordítása. Felhívjuk figyelmét, hogy mivel a fordításokat géppel generálják, nem minden fordítás lesz tökéletes. Ezt a weboldalt és weblapjait angol nyelven kívánják olvasni. A webhely és weboldalainak fordítása részben vagy egészben pontatlan és pontatlan lehet. Ezt a fordítást egy gyakorlat biztosítja.
A fehérjetechnikai technikák elengedhetetlen részei a különféle ipari folyamatokban alkalmazható specifikus tulajdonságú fehérjék testreszabásának vagy előállításának. Ezért elengedhetetlenek a biotechnológiai kutatáshoz.
Ezek a módszerek azonban nagymértékben függenek attól, hogy képesek-e izolálni és megtisztítani a kívánt fehérjéket, hogy meg lehessen érteni azok anyagi és kémiai tulajdonságait, valamint a tercier struktúrájukat és a ligandumokkal és szubsztrátokkal való kölcsönhatásukat.
A tisztítási folyamat folytatásának intenzitása attól függ, hogy a fehérjét hogyan kell felhasználni. Például a gyógyszerészeti és élelmiszer-fehérjéket magas fokú tisztaságra kell hozni, és több egymást követő szakaszon kell átmenni, csak lehetséges, mivel minden egyes művelettel elkerülhetetlenül elpusztul egy bizonyos fehérje.
A fehérjemolekulák tisztítása egyszerűbb, mint a fehérjetisztító vegyületek.
1. lépés: Nyersfehérje-kivonat előállítása
Az intracelluláris fehérjék nyers kivonatait úgy állítják elő, hogy a sejtet kémiai vagy mechanikus módszerekkel lizálják. Ezután a szennyeződéseket centrifugálással eltávolítják. A megfelelő felülúszó adása messze áll a tiszta formától, sok más makro-utasítással és mikromolekulával keveredik.
Az extracelluláris fehérjéket az oldat centrifugálásával és a sejtek eltávolításával nyerjük. A termostabil enzimek nyers kivonatának megszerzésére szolgáló specifikus módszer az, hogy a keveréket más fehérjék denaturálása céljából felmelegítik, majd lehűtik, hogy felvegyék a kívánt hőstabil fehérjéket, végül centrifugálva eltávolítsák a denaturált fehérjéket.
2. lépés: Közbenső tisztítás
Sózás
A nyers kivonatban lévő fehérjéket ezután megtisztítjuk erősen koncentrált sóoldatból, például ammónium-szulfátból kicsapva. Ez a fehérje alacsony sótartalma alapján működik magas sókoncentrációk esetén. Azonban nem minden fehérje csapódik le azonos sókoncentrációban, ami azt jelenti, hogy a sózás a fehérjék lebontásában is segít. Alkalmazható fehérjék oldatban történő koncentrálására is. Ez a művelet háromszorosára növeli a tisztaságot, és az oldatban lévő fehérje 92% -át kinyerik.
Dialízis
A fehérjék nagy molekulák, és ez azt jelenti, hogy a fehérjsók megmaradnak, ha az oldatot féligáteresztő membránon vezetik át. A cellulóz a dialízis tipikus membránja. A dialízis nem alkalmazható a különböző molekulatömegű fehérjék elválasztására.
Kromatográfia
A sós külső fehérjék eltávolítására alkalmazott egyéb technikák közé tartozik a kromatográfia és a gélkizárásos szűrés. Ezek ma már előkészített készletekként kaphatók sok normál fehérje számára, és gyakran alkalmasak nagy teljesítményű folyamatokhoz.
A gélszűrés porózus polimer gyöngyök, például dextrán vagy agaróz oszlop méretének elválasztása alapján működik. Nagy molekulák csak a sarkak közötti tereken tudnak áthaladni, míg a kisebbek elfoglalják ezt a két teret és a sarok belsejében lévő teret, lassítva őket. Így az eluens olyan molekulákat tartalmaz, amelyek méretük szerint sorrendben jelennek meg, a nagyobbaktól a kisebbekig. Fordított fázisú vagy ioncserélő kromatográfiás technikákat is alkalmaznak, amelyek a differenciál hidrofób tulajdonságok és a töltés alapján működnek. A reverz fázisú kromatográfia alkalmazása korlátozott lehet a fehérje szerves oldószerekkel történő lehetséges denaturációja miatt.