Inzulininjekció és hemolimfa-extrakció az inzulinérzékenység mérésére felnőtt Drosophila-ban

Összegzés

A Drosophila melanogaster gyümölcslegyben található konzervált útvonalak jelző inzulin jelképezik ezt a szervezetet az anyagcsere-rendellenességek, különösen a II-es típusú cukorbetegség modellezésében. Ebből a célból elengedhetetlen egy fiziológiai elemzés létrehozása a szisztémás hatású inzulin hatékony mérésére a perifériás glükóz eliminációjában a felnőtt légyben.

Absztrakt

Jegyzőkönyv

1. Az inzulinoldat elkészítése

  1. Készítsen új szarvasmarha-inzulin oldatot az inzulin PBS-ben való feloldásával, hogy 0,01 mg/ml koncentrációt kapjon. Az inzulint/PBS-t és a kontroll PBS-oldatokat jégen kell tartani az injekciós eljárás során. Ezeket az oldatokat 0,5% (v/v) kék FD&C sz. 1 ételfesték.

2. A tű előkészítése és az injekció beállítása

3. Légy előkészítés

  1. Tíz napos nőstény legyeket használnak injekciós kísérletekhez. Gyűjtse össze a legyeket a kikelés után 24 órán belül. A legyeket nedvesített CO 2 -val altassuk el egy gázpárnán, válogassuk a hímeket, és helyezzünk nőstény legyeket standard vagy kezelési rendet tartalmazó injekciós üvegekbe. A női legyeket 10 napig tartsuk kísérleti étrenden.
  2. A kikelés és a kísérleti étrenden történő szétválasztás után a tizedik napon a legyeket az ételt tartalmazó injekciós üvegekből 5 ml 2% -os agar dugót tartalmazó injekciós üvegekbe helyezzük, és éheztetjük őket 12-16 óráig.
  3. Vigye az éhes legyeket 10% glükózszűrőt tartalmazó injekciós üvegekbe, hogy az inzulininjekció előtt 1 órán át áztassa.
  4. A glükóz étkezés után rövid ideig altassa el a legyeket nedvesített CO 2 -val, majd hidegen jégen rögzítse őket.

4. Injekciós eljárás

5. Hemolimfa gyűjtés

6. A hemolimf-glükóz meghatározása

  1. Vigye ki a hemolimfa mintákat mikrolemezre, amely 100 µl Infinity Glucose Reagent tartalmaz. Hemolimfa minták betöltése közben a lemezt jégen tartsa.
  2. Készítsen standard görbét külön-külön 1 µl töltésével az 50 mM, 25 mm, 12,5 mm, 6,25 mm és 3,125 mM glükóz törzsoldatokból.
  3. Inkubálja a mintákat 37 ° C-on 10 percig.
  4. Az abszorbancia detektálása 340 nm-en.
  5. Számoljuk meg az összegyűjtött hemolimfa térfogatát, és az ismert glükózkoncentrációjú standard görbe alapján határozzuk meg a minta glükózkoncentrációját.

7. Reprezentatív eredmények

Tipikus inzulin-toleráns választ észlelnek az injektált inzulinlegyek, ahol a keringő glükózszint csökkenését észlelik 15 perccel az injekció beadása után. Ezzel szemben a PBS-be injektált legyeknél ilyen reakció nem látható (3. ábra). Ez a perifériás glükóz eliminációs válasz az injektált legyek inzulinjától az injekció beadása után akár 30 percig is folytatódik. Minden egyes injekciós csoportban 4-5 legyenként rendszeresen kivonunk 0,2-0,5 l hemolimfot. Minden kísérlet három injekciós csoportot tartalmaz.