Kvantitatív ratiometrikus érzékelő az idő dinamikus elemzéséhez
- Témák
- Absztrakt
- bevezetés
- Eredmények
- Szenzorok fejlesztése, értékelése és optimalizálása emlős sejtrendszerben
- A ratiometrikus auxin szenzor jellemzése és alkalmazása növényi sejtekben
- Vita
- A módszerek
- Plazmidszerkezet
- Emlős sejttenyészet, transzfekció és auxin kezelés
- Növényi anyag
- Protoplasztok izolálása, transzformáció és auxin feldolgozás
- A transzgenikus expresszió elemzése
- Az induktorok
- Lumineszcencia elemzés
- statisztikai elemzések
- További információ
- PDF fájlok
- További információ
- Hozzászólások
Témák
- Ban,-ben
- Biológiai technikák
- Molekuláris mérnöki üzemek
- Jelzőgyár
Absztrakt
A növényi sejtekben az auxin-közvetített folyamatok kvantitatív, időben felbontott elemzése még mindig korlátozott. Szinergikus megközelítést alkalmazva a szintetikus emlős- és növénybiológiában, kifejlesztettünk egy új ratiometrikus fény-fény bioszenzort, amely széles körben alkalmazható az auxin anyagcseréjének, transzportjának és jelátvitelének tanulmányozására. A genetikailag kódolt bioszenzorunk érzékenysége és kinetikai tulajdonságai új perspektívákat nyitnak a növény növekedésében és fejlődésében az auxin rendkívül összetett dinamikájának elemzéséhez.
bevezetés
Ezen követelmények teljesítése érdekében kifejlesztettünk egy kemilumineszcens ratiometrikus érzékelőt, a TIR1 és az Aux/IAA közötti auxin-mediált kölcsönhatás felhasználásával. A lebomláson alapuló szenzor tranziens sejtes génexpressziós rendszerben, például protoplasztokban történő alkalmazásával nagy időbeli felbontás várható. Ezenkívül a lumineszcens riporterek magas jel/zaj arányt és ezáltal nagy érzékenységet biztosítanak, valamint a szükséges széles dinamikus tartományt, 13, 14. Végül a ratiometrikus kvantifikációk elvégzése hozzájárul az eszköz robusztusságához azáltal, hogy korrigálja a sejtekre jellemző különbségeket vagy a tranziens vizsgálatokra jellemző változékonyságot 15 .
Eredmények
Szenzorok fejlesztése, értékelése és optimalizálása emlős sejtrendszerben
A ratiometrikus auxin érzékelő specifikációinak teljesítése érdekében egy szintetikus konstrukciót terveztünk, amely szentjánosbogár-luciferázt tartalmaz, amely az Aux/IAA fehérjék (érzékelő modul) auxintól függő lebomlási szekvenciájához/eleméhez fuzionált, és vese lucillázát (normalizáló elem) (érzékelő kialakítását 1a. Ábra). A két komponenst egy 16 2A peptid kapcsolja össze, amely sztöchiometrikus együttes expressziójukat eredményezi, ezáltal lehetővé téve az auxin-függő szenzor lebomlásának figyelemmel kísérését a szentjánosbogár és a renilla lumineszcencia csökkenése formájában. (F/R) (1a. Ábra).
Ezért kihasználtuk az Aux/IAA fehérjék leírt jellemzőit az érzékelő modulok racionális tervezéséhez: i) szintetikus érzékelő modulokat fejlesztettek ki különböző Aux/IAA fehérjékből annak érdekében, hogy különböző dinamikus tartományú auxint kapjanak érzékelők érzékenység; ii) az érzékelő endogén auxin szignálkomponensekkel való lehetséges interferenciájának minimalizálása érdekében a különféle Aux/IAA fehérjéknek csak a 13 aminosav minimális degronszekvenciáját használták fel.
Ennek megfelelően szenzormodulként három különböző Aux/IAA 13 aminosav-szekvenciáját használtuk, amelyek az érzékenységek széles skáláját ölelték fel, nevezetesen AtIAA17, AtIAA28 és AtIAA31, 33 nM, 75 nM és> 1000. nM auxin kötődési affinitással illetve 10. Az AtIAA17 13 aminosav minimális degronszekvenciája egybeesik 22 Aux/IAA 18 fehérje 13 aminosav-érzékeny auxin-érzékeny konszenzusszekvenciájával (QVVGWPPVRSYRK, min17-Luc szenzor, 1. kiegészítő táblázat), míg az AtIAA28 és AtIAA31 szekvenciája jelentősen eltér (PVVGWPPVRSSRR és ARQDWPPIKSRLR, a min28-Luc és a min31-Luc szenzorok előállítása, 1. kiegészítő táblázat). Szenzormodul nélküli konstrukció negatív rendszervezérlésként szolgált (Ctrl-Luc, vezérlőkonstrukció, 1. kiegészítő táblázat).
(a) A protoplasztok kiválasztott szenzorváltozatainak kezdeti jellemzése thaliana. 24 órával a transzformáció után az FL-Luc, L2min17-Luc vagy Ctrl-Luc expresszáló protoplasztokat 5, 15 vagy 45 percig inkubáltuk hormonok nélküli táptalajban vagy auxin komplementtel (1 μM IAA). A ratiometrikus luciferáz aktivitásokat átlagként ± sem (n = 6) mutatjuk be. Statisztikai jelentéseket mutatunk be (kétfarkú t-teszt, * P 10, 23. Figyelemre méltó, hogy a nagy érzékenység és reaktivitás mellett a konszenzus szekvencia szenzor képes megkülönböztetni a különböző auxin analógokat, ezáltal feltárva annak lehetőségét fiziológiailag aktív vegyületek anyagcseréjének, transzportjának és szignáljának tanulmányozása.
Vita
Az auxin mennyiségi monitorozása az élő sejtekben nehéznek bizonyult. Ratiometrikus lumineszcens riporter rendszer segítségével degradáció-alapú bioszenzort tudtunk kifejleszteni egysejtű rendszerek számára, kielégítve a komplex auxin-közvetített folyamatok tanulmányozásához szükséges magas érzékenységi és időbeli felbontási követelményeket. Ennek érdekében egy szinergikus szintetikus biológiai megközelítést alkalmaztunk, amely magában foglalja a szenzor tervezését és előzetes jellemzését interferenciamentes heterológ emlős sejtrendszerben, majd sikeres alkalmazását a növényi sejtekben.