Michael Preukschas, született Bremenben - PDF ingyenes letöltés
A deoxyhypusin-szintáz, mint a glioblastoma multiforme kezelésének lehetséges célpontja, valamint az eifarióta transzlációs iniciációs faktor, az eif-5a2 szerepe in vivo disszertációban, a természettudományok doktora cím megszerzéséhez a Hamburgi Egyetem Matematikai, Számítástechnikai és Természettudományi Karának Biológiai Karán Michael Preukschas, 1981. szeptember 27-én született, Bremen, Hamburg, 2012
Javított verzió A vitás dátum: 2013. augusztus 30. 1. bíráló: Prof. Dr. Joachim Hauber 2. bíráló: Prof. Dr. Julia Kehr ii
A tudomány nagy tragédiája - egy gyönyörű hipotézis megsemmisítése egy csúnya tény által. "Thomas Henry Huxley elnöki beszéd a Brit Szövetségnél 1870-ig," Biogenesis és Abiogenesis "(Collected Essays, 8. évf.) Iii
A rövidítések listája 6! A2 munka2 alatt előállított2publikációk2 és! Poszterbemutatók2. 2100! 7! Irodalom2. 2102! 8.! 2. függelék 2115! 8.1! Alapozó szekvenciák 2. 2115! 8.2! Lentiral2 vektorok2. 2116! 8,3! eifj5ajexpression2in2glioblastomen2 (Rembrandtjdatabase) 2. 2117! 8.4! Affidavit2biztosítás2. 2122! iv
Rövidítések listája TMZ TPZ WHO Temozolomide Daganatszaporító Sejtek Egészségügyi Világszervezet (Egészségügyi Világszervezet) iii
Összefoglaló áll. Ennek a knockout egérnek az segítségével új ismeretek szerezhetők az emlősök szisztémás és szervspecifikus funkcióiról. iii
A iniciáció részben mrna-szinten kifejeződik, de az 5,6,8 fehérjeszinten szinte nem mutatható ki. Mindkét fehérjét a saját génje kódolja, és mindegyiket öt transzkriptummá írják át. Az átírások néha eltérő 3 -UTR-eket tartalmaznak, vagy csonkoltak, ami befolyásolja az eif-5a2-mrna transzlációs sebességét és poliszómaképződését, különösen az eif-5a2 átírások esetében, és esetleg részt vesz a 8. kifejezés szabályozásában. Az eif-5a2-mrna szintén alacsonyabb stabilitással rendelkezik, mint az eif-5a. Tehát a két izoform különféle expressziójának legalább egy része látszólag megmagyarázható ezekkel a poszt-transzkripciós mechanizmusokkal. A DHS enzim felelős a hypusinszintézis első lépéséért. A legtöbb eukarióta egyetlen dhps génnel rendelkezik, amely konzerválódott az eukariótákban és az archeákban, és amely kódolja a DHS-t. Eddig három transzkripciós változatot találtak az embereknél, amelyek közül azonban csak egy kódolja az aktív 9 fehérjét. A poliamin-spermidin a DHS szubsztrátja. Az aminobutil-maradék átvitele a spermidinből az eif-5a-lizin 50-be NAD-függő folyamat, és elvileg reverzibilis. A DHS a
Bevezetés a hasnyálmirigy-szigetek sejtjeinek apoptózissal kapcsolatos halálának csökkentésére. Az eif-5a szerepe a cukorbetegség kialakulásában döntő fontosságú gyulladásos reakciókban más forgatókönyvekben is megmutatkozott. A CPSI-2364 nevű CNI-1493 szájon át beadható formáját a bél krónikus gyulladásos autoimmun betegségének, a Crohn-kór kezelésének tesztelték. Itt is gyulladáscsökkentő hatást mutattak ki, amely a DHS gátlásával társult. Egyre több tanulmány támasztja alá azt a hipotézist, miszerint az eif-5a fehérjék és a hypusinképző enzimek sok rosszindulatú daganat patogenezisében vesznek részt. Ezért ezen fehérjék más rákos megbetegedésekben való részvételének értékelése egy lehetőség volt. Itt különös figyelmet fordítottak a rosszindulatú daganatok, amelyekre eddig csak néhány hatékony terápiás lehetőség állt rendelkezésre. Ide tartoznak különösen a magasabb fokú agydaganatok, amelyek kezelése ritkán sikerül, függetlenül attól, hogy műtéti úton, klasszikus rádió-/kemoterápiával vagy célzott molekuláris terápiákkal. Ezért az eif-5a1/2, a DHS és a DOHH-t mint lehetséges terápiás célpontokat vizsgálták magasabb fokú asztrocitómákban. 9.
A daganatok közötti heterogenitás figyelembevételével minden betegnél szükség lesz a specifikus onkogének bevezetésére. Mivel a 120 GBM daganaton belül is nagy a heterogenitás és valószínűleg a klónfejlődés, és gyakran nem minden mutációt lehet kimutatni egy biopsziával 121, az új, költséghatékony technológiák (pl. Exome szekvenálás) és a célzás valószínűleg eltérő lesz, a nem redundáns célok segítenek leküzdeni ezeket a nehézségeket. 18
Anyag és módszerek 19 2 Anyag és módszerek 2.1 Anyag 2.1.1 Vegyszerek és táptalajok baktériumokhoz 2. táblázat: Az ebben a munkában használt vegyszerek és reagensek. Kémiai/Reagens/Közepes Aceglow ECL-oldat Akrilamid-Bisz, 30% Adriamycin (Doxorubicin) Agaróz Ampicillin BCNU Bradford Reagens BSA Bromophenol Blue CHAPS Chloroform Chloroquine Difosfát DEPC-Water DMEM + Glutamax Etacetac Acids Borjúszérum (FCS) Glutáraldehid (50%) Glicin Glicerin Hemalum Mayer izopropanol kálium-acetát gyártója szerint Peqlab Roth Sigma-Aldrich Invitrogen Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Bio-Rad Roth Roth Roth Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Invitrogen Invitrogen Roth Roth Sigma-Aldrich Invitrogen Roth Roth Roth Roth Roth Roth 19
Anyag és módszerek 20 Kálium-klorid LB agar LB táptalaj sovány tejpor β-merkaptoetanol Metanol (MeOH) M-MuLV Nátrium-acetát Nátrium-klorid Nátrium-hidroxid Nátrium-ortovanadát Nem esszenciális aminosavak Oligo d (t) Primer Paraformaldehid PBS Penicillin/Streptomycin R RibidolOutin Ribinol Rotiszint eco plus sósav (HCl) SDS SOC-Medium Spermine Spermidin SYBR Green PCR Master Mix TEMED Temozolomide Tritium spermidin Tris Base Tris-HCl TriFast Roth Roth Roth Roth Sigma-Aldrich JT Fermentas Baker Roth Roth J.T. Baker Sigma-Aldrich Gibco Invitrogen Sigma-Aldrich Lonza Gibco GE Healthcare Invitrogen Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Roth Invitrogen Fermentas Roth Roth Sigma-Aldrich Roth Invitrogen Roth Roth Finnzymes Roth Sigma-Aldrich Perkin-Elmer Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich
Anyagok és módszerek 21 Trypánkék TritonX-100 0,5% tripszin + EDTA Tween20 Karbamid Biochrom Sigma-Aldrich Gibco Roth Sigma-Aldrich 21
Anyagok és módszerek 22 2.1.2 Berendezések és anyagok A felsorolásban nem szereplő anyagok és berendezések szabványos laboratóriumi felszerelések 3. táblázat: A munkában használt berendezések és anyagok. Berendezések/anyagok Cryo csövek CultureSlides, 4 kamra Áramlási citométer FACSCalibur elektroforézis kamrák FUSION SL Advance Gel dokumentáció Szekrény Eagle Eye II GenePulser XCell Homogenizátor Omni TH Immobilon PVDF membrán Mastercycler Gradient Microplate olvasó Wallac Victor mikroszkóp Cellikultúra Axiovert 40 mill, ND 1000 tápegység PowerPac NuPage poliakrilamid gélek ProteanXL Size ExtraThick Blot Paper Realtime PCR-Cycler Mx3000P röntgenfilmek Röntgenkazetta TransBlot SemiDry-Blotter Tri-Carb 2900TR Vi-cellás XR sejttenyésztő lombikok, különböző méretű sejttenyésztő edények és tányérok 54 centrifuga centrifuga Biosciences BD Biosciences Biorad/Invitrogen Peqlab Stratagene Biorad Omni International Milipore Eppendorf Perkin-Elmer Zeiss Millipore Roth Nalgene Peqlab Eppendorf Biorad Invitrogen Biorad Stratagene Thermo-Scientific Rego Biorad Perkin-Elmer Beckman-Coulter Sarste dt Sarstedt Eppendorf Eppendorf Sarstedt 22
Anyagok és módszerek 23 2.1.3 Pufferek és oldatok Eltérő rendelkezés hiányában a készítéshez Millipore szűrt H20-t alkalmaztunk, és az oldatokat szobahőmérsékleten (RT) tároltuk. "4. táblázat: Használt pufferek és oldatok Megoldás Bakteriális munka Feloldó oldat Összetétel 50 mm Glükóz 25 mm Tris, pH 8,0 10 mm EDTA, pH 8,0 Tárolás 4 C-os lúgos lízispufferben 0,2 N NaOH 0,5% SDS kicsapási puffer 25% 5M KAc 15% HCl TE puffer molekuláris biológia 50x TAE fehérje biokémia 100% triklór-ecetsav (TCA) ) 0,1 mm EDTA 10 mm Tris (pH 7,5) 242 g Tris bázis 57,1 ml acetát 100 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0) H 2O 1000 ml 40 g TCA 20 ml H 2 O 0,5 M Tris, pH 6,8 50 mm DTT 6 g Tris alap 60 ml H 2 O pH 6,8 H 2 O 100 ml 23
Anyagok és módszerek 24 1,5 M Tris 27,23 g Tris bázis 80 ml H 2 O pH 8,8 H 2 O 100 ml 5x SDS futópuffer 360 g glicin 75 g Tris bázis H 2 O 1000 ml egyensúlyi puffer 1 0,375 M Tris-HCl (ph 8,8) 6 M karbamid 20% glicerin (v/v) 2% SDS (w/v) 130 mm DTT egyensúlyi puffer 2 0,375 M Tris-HCl (ph 8,8) 6 M karbamid 20% glicerin (v/v) 2% SDS (w/v) 135 mm jód-acetamid PBST 2000 ml PBS 1 ml Tween20 karbamidpuffer 8 M karbamid 2 M tiokarbamid 2% CHAPS 50 mm DTT félszáraz blot puffer 25 g SDS 5,82 g Trisz bázis 2,93 g glicin 1,90 ml 20% SDS 200 ml metanol H 2 O 1000 ml tárolással 4 C-on 24
Anyag és módszerek 25 Sejtlízis puffer (RIPA) 150 µl 1 M NaCl 50 µl 1 M Tris-HCl (ph 7,6) 50 µl 20% Nonident P40 (v/v) 25 µl 10% Na deoxycholate (v/v) 10 µl proteázinhibitor és 1000 µl H 2 O sejtciklus, apoptózis és öregedési DNS extrakciós puffer 192 ml 0,2 M Na 2 HPO 4 8 ml 0,1% Triton X-100 (v/v) pH 7,8 propidium-jodid oldat 200 µg propidium-jodid 1 mg RNáz 10 ml PBS rögzítő oldat 0,25% glutáraldehid (250 µl) 2% paraformaldehid (1 g) PBS (pH 5,5; 50 ml) 20x kálium-cianid (KC) 820 mg K 3 F (CN) 6 1050 mg K 4 FE (CN) 6 x 3H 2 O 25 ml PBS 40x X-GAL 40 mg 5-bróm-4-klór-3-indolil-β-d-galaktozid 1 ml N, N-dimetil-formamid 2.1.4 Oligonukleotidok Az alkalmazott oligonukleotidokat Ha lehetséges, a Primer3 szoftver segítségével tervezték. A primerek tulajdonságait a homológ rekombinációkhoz (különösen a dimerképződésre való hajlamot) az Oligoanalyzer 1.2 szoftverrel (Freeware, T. Kuulasmaa, Turku Egyetem, Finnország) határoztuk meg. 25-én
Anyag és módszerek 26 2.1.5 Antitestek 5. táblázat: Az immunoblotok és a FACS alkalmazásokhoz használt primer és szekunder antitestek. Megadják a célfehérjét, a származási hosztot, az alkalmazott hígítást és a gyártót. Antitest gazdahígítás Gyártó Anti-Mouse HRP Juh 1: 10000 GE Healthcare Nyúlellenes HRP Kecske 1: 10000 Sejtjelző Technológia Anti-eIF-5A Nyúl 1: 5000 Novus Anti-DHS Nyúl 1: 1000 Santa Cruz Anti-DOHH Nyúl 1: 1000 Eurogentec Anti-p53 Nyúl 1: 1000 Santa Cruz Anti-p21 Waf1/Cip1 Nyúl 1: 1000 Sejtjelző Technológia AKT Nyúl 1: 1000 Sejt Jelző Technológia Anti-PAKT Nyúl 1: 1000 Sejt Jelző Technológia Anti-Rb Nyúl 1: 1000 Sejtjelző technológiák anti-pRB nyúl 1: 1000 Sejtjelző technológiák anti-β-tubulin egér 1: 10000 Onkogén anti-aktív-kaszpáz3- Nyúl 1: 5 BD Pharmingen PE IgG 1 -PE izotípusú egér 1: 5 BD Pharmingen Kontroll 2.1.6 Táptalaj sejttenyésztéshez 6. táblázat: Az ebben a munkában használt sejttenyészet táptalajok és azok összetétele. Megoldás Gliommedium összetétel Dulbeccos módosított Eagle táptalaj 4500 mg/l glükóz L-glutamin 1 mm nátrium-piruvát 1: 100 penicillin/sztreptomicin 10% FCS asztrocita táptalaj DMEM/F-12 4500 mg/l glükóz 1 mm L-glutamin 26
Anyag és módszerek 27 1 mm-es nátrium-piruvát 1: 100 penicillin/sztreptomicin 20% FCS DMEM táptalaj 10% DMSO DMEM-ES táptalaj A Dulbecco által módosított Eagle táptalaj (25 mm HEPES) 15% FCS 2 mm L-glutamin 0,1 mM MEM 0,05 mg/ml penicillin/sztreptomicin nukleozid keverék (adenozin 1,3 µg/ml; guanozin 1, 37 µg/ml; citidin 1,18 µg/ml; uridin 1,18 µg/ml; timidin 0,38 µg/ml) 1 mm nátrium-piruvát 100 µm 2-merkaptoetanol 1000 E/ml ESGRO-LIF választható adalékanyag: 150 250 µg/ml G418 KSOM/HEPES táptalaj, pH 7,4 95 mm NaCl 2,5 mm KCl 350 µm KH4PO4 200 µm MgSO 4 táptalaj MEF számára (tápláló sejtek) DMEM 9% FBS 0,1 mm NEAA 50 U penicillin/50 µg/ml sztreptomicin Embrionális őssejt táptalaj 27
Anyagok és módszerek 28 DMEM 25 mm HEPES 15% FBS 2 mm L-glutamin 0,1 mm NEAA 50 U penicillin/50 µg/ml sztreptomicin-nukleozid keverék (1,3 µg/ml adenozin; 1,37 µg/ml guanozin; 1, 18 µg/ml citidin; 1,18 µg/ml uridin; 0,38 µg/ml timidin) 1 mm nátrium-piruvát 100 µm β-merkaptoetanol 1000 E/ml ESGRO-LIF 28
Anyag és módszerek 29 2.1.7 Felhasznált sejtek Az ebben a munkában használt sejtvonalakat és primer sejteket a 7. táblázat tartalmazza. Primer egér embrionális fibroblasztokat (MEF) is használtak tápláló sejtekként az ES sejtek tenyésztéséhez. 7. táblázat: Az ebben a munkában használt sejtvonalak, valamint tápanyag-közegük és eredetük. Sejt táptalaj forrás Phoenix Eco ϕ - (módosított HEK293T, stabilan transzfektálva két plazmiddal, amelyek az MML vírusszekvenciákat kódolják: "gag", "pol" és "env".) DMEM Stanford University (USA) U87-MG (Adherens humán asztrocitoma sejtvonal.), WHO IV fokozatú asztrocitómából izolálva Releváns mutációk: Törölt Ink4Arf lokusz) Glioma táptalaj ATCC (szám: HTB-14) G55T2 (Adherens humán asztrocitóma sejtvonal, izolálva egy WHO IV fokozatú asztrocitómából. pontmutáció a DNS-kötő doménben) Gliommedium Idegsebészet, Hamburg-Eppendorf Egyetemi Orvosi Központ; Westphal 1994 NHA (normál emberi asztrociták, primer, differenciált asztrociták az emberi agyszövetektől) asztrocita táptalaj Invitrogen (Darmstadt; N7805-100) C57BL/6N JM8.F6 sejtek (egér embrionális őssejtek) DMEM-ES táptalaj W. Skarnes, Wellcome Trust Sanger Intézet, Kalifornia, USA 29
Anyag és módszerek A fehérjék elektroforetikus szétválasztására 36 SDS-12% poliakrilamid gélt használtunk. Az üveglemezeket az öntőállványba helyeztük, és az elválasztó gélt (10 ml) összekevertük a következő oldatokból: 3,35 ml H 2 O 4 ml 30% -os akrilamid 2,5 ml 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8) 50 µl 20% SDS 50 μl 10% APS 10 μl TEMED Az elegyet az üveglemezek közé öntjük és 1 ml izopropanollal lefedjük, amíg körülbelül 20 perc múlva polimerizálódik. A gyűjtő gélt (4%, 5 ml) időközben elkészítettük: 3,05 ml H 2 O 0,66 ml 30% akrilamid 1,25 ml 0,5 M Tris-HCl (pH 6,8) 25 µl 20% SDS 5 µl TEMED Az izopropanol eltávolítása és az elválasztó gél vízzel való átöblítése után a gyűjtő gélt az elválasztó gélre öntjük, és a zsebfésűt (10 zseb, 1,5 mm vastag) behelyezzük. 20 óra elteltével a gélt a futókamrába helyeztük, és ezt futópufferrel töltöttük meg. A minta előkészítése 5x töltőpuffert és 20x denaturálószert (mindkettő Fermentas, St. Leon-Roth cégtől) összekevertünk a kívánt térfogatú fehérje-lizátummal, és RIPA pufferrel feltöltjük a kívánt térfogatra (10 50 μl). Az elegyet 5 percig 95 ° C-on forraljuk a fehérjék denaturálása érdekében, majd jégen tároljuk. 36
Eredmények 73 AB testtömeg [g] 30 28 26 24 22 PBS 0,1 mg GC7 0,15 mg GC7 0,2 mg GC7 20 1 3 5 8 10 12 15 17 C 1,0 napos tumor súlya [g] 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 PBS 0,1 mg GC7 0,15 mg GC7 0,2 mg GC7 20. ábra: Az in vivo xenograft kísérletek vizsgálati szekvenciája és a GC7 hatása in vivo G55T2 xenograft modellben az állatok tömegére és a tumor tömegére. (A) G55T2 sejtekkel végzett in vivo xenograft kísérletek tesztszekvenciája. A G55T2 sejteket szubkután dorzálisan injektáltuk az NSG egerekbe. Sikeres növekedés és daganatképződés után a GC7-et naponta i.p. beadni. Hétnapos kezelés után a tumorokat előkészítettük, lemértük, megmértük és megőriztük a fehérje-extrakcióhoz/immunhisztokémiai festéshez. A hypusin státuszt (és így a GC7 hatását) 2D Western blot (B) segítségével határoztuk meg. Az NSG egerek testtömegének meghatározása a G55T2 sejtek szubkután injekciója és napi 0,1 mg, 0,15 mg, 0, 2 mg GC7 vagy PBS oldószer kontrollként (átlag ± SEM). (C) tumor súlya 7 napos GC7 kezelés után. (Az egyes daganatok súlya és átlag/kohorsz ± SEM). A kezelés látható (pl. Bozontos szőr, kopott területek). BehaV 73 is
Eredmények 75 3.3 Eif5a2 knockout egér létrehozása 3.3.1 Az eif5a2 cél konstrukció létrehozása Az eif5a2 gén szekvencia információi alapján (az egér homológjának neve az emberi eif-5a génnel) kiválasztottunk egy klónozási stratégiát és a törlendő szekvencia régiót. Ez a terület magában foglalja az 1 3 exonokat, és magában foglalja a 22. ábrát: A szubklónozás sematikus ábrázolása homológ rekombinációval. A BAC-hoz homológ régiókat (kék) tartalmazó lineáris minimális vektort (fekete) elektroporálunk egy E. coli klónba, amely BAC-t hordoz a módosítandó DNS-szegmenssel (szürke). így a transzláció indul és az 50 lizin a 2. exonban, amely a kritikus hypusin-módosítást hordozza. Az 1.2.7. Szakaszban leírtak szerint a BAC RP23-361F2 szolgál kiindulópontként a vektor konstrukció klónozásához. A rekombinálás módszerét (klónozás homológ rekombinációval) itt alkalmaztuk (példaként mutatjuk be a 22. ábrán). Az eif5a2 gén integritását a BAC-ban először szekvenálással igazolták. A minimális pstartk vektorot ezután PCR-rel amplifikáltuk, és a primerek segítségével az eif5a2 gén 5. és 3. helyén elhelyezkedő homológiakarokat adtunk hozzá. A PCR-terméket 75 agarózgél-elektroforézissel analizáltuk
A munkából származó publikációk és poszterbemutatások 101 A rákkal kapcsolatos hypusine módosítás átfogó fehérje-interakciós hálózata. Sievert H, Venz S, Platas Barradas O, Schaletzky M, Preukschas M, Bokemeyer C, Pörtner R, Walther R, Balabanov S (2011): EMBO Conference Cancer Proteomics 2011 Poster prezentáció A telomerrel társított szekréciós fenotípus (TASP) együttműködik a BCR- ABL az egér hematopoietikus őssejtek rosszindulatú szaporodásának elősegítésére Melanie Braig, Nora Pällmann, Michael Preukschas, Doris Steinemann, Anne Gompf, Karl L. Rudolph, Andreas Schuppert, Stefan Balabanov és Tim H. Brümmendorf Poszter előadás a 101-es előkészítésben
115. függelék 8 2. függelék 8.1 Alapozó szekvenciák ef5a2 kiütéses konstrukció: nevezze el az eif5a2 primer nevét pstartkban pstartrev-seq1-r pstart-k Seq fwd alapozó homológ karok hozzáadásához az eif5a2-hez vagy az A2 primer1 A2 primer2 eif5a2 ellenállási kazettákhoz. Kanneo-la2 - az eif5a2-kanneo-loxp-rev eif5a2-kanneo-frt-f eif5a2-kanneo-frt-r szonda primer 3'-szonda3-f 3'-szonda3-f További szekvenáló primerek pws-tk6-ori-f A2-TK6-Ori -r A2-A2 TK6-3'-f-r-TK6-3' szekvenciát (5'-3 „) tgacagcagacgtgcactgg CTC GGG CCC CAA ATA ATG AT gagcccctcctgtacagcctgggtgttggtgaagggggaatccaagagttacgc GTcgactgaattggttcctttaaagc gagacagacgagttaaggagatacaagaggaaagaaggaagatggaggaa gccgcactcgagatatctagaccca aactgaagatgaggatgcatctcgcccgggaacactgcgaagcttcaaacaattaa ccctcactaaagggcg gtgctgcggattagtgcacttccggcgtgcagagctgcctgcagtcgacttaatacga ctcactatagggctc CTAGGGCCGGCCATTAATaattaaccctcactaaag CTAGTTAATTAAAAGCTTGTTAACtaatacgactcactatag cacacattacatgaattataagg ctgtcccagctcttaactgc gtgagcgaggaagcggaatatatc catccgtcagtctagtaatttcc gggaaatg tggattgctgtc tataaacccgcagtagcgtg 115