Minőségi inozitol-pirofoszfátok protokolljának elkészítése (németre fordítva)

Összegzés

Az inozit-pirofoszfátok fontos szerepet játszanak olyan emberi betegségekben, mint a rák, a cukorbetegség és az elhízás, azonban a pontos hatásmechanizmus ellentmondásos. A kereskedelemben kapható inozit-pirofoszfátok hiánya problematikussá teszi a részletes vizsgálatokat. Itt leírunk egy egyszerű eljárást milligramm inozitol-pirofoszfát előállítására és izolálására.

Absztrakt

A myo-inozitol természetesen változatlan formában vagy bonyolultabb foszforilezett származékokban fordul elő. A legújabbak közül az eukarióta sejtekben a két leggyakoribb az inozit-pentakiszfoszfát (IP 5) és az inozit-hexakiszfoszfát (fitinsav vagy IP 6). Az IP 5 és az IP 6 az inozitol-pirofoszfát-molekulák prekurzorai, amelyek egy vagy több pirofoszfát-kötést tartalmaznak1. Az IP 6 foszforilezésével difoszhoinozitol-pentakiszfoszfátot (IP 7 vagy PP-IP 5) és biszdifoszhoinozitol-tetrakiszfoszfátot (IP 8 vagy (PP) 2-IP 4) állítanak elő. Az eddigi összes eukarióta szervezetből inozitol-pirofoszfátokat izoláltak. Ezenkívül az inozitol-pirofoszfát szintézisért felelős két különböző osztályú enzimek nagyon konzerváltak a 2-4. Evolúció során.

Az IP 6 kinázok (IP 6 Ks) óriási katalitikus rugalmassággal bírnak, átalakítva az IP 5-et és az IP 6-ot PP-IP 4-re és IP 7-re, vagy pedig ezeket a termékeket szubsztrátként felhasználva, elősegítve a komplex molekulák képződését 5, 6. A közelmúltban a pirofoszfát-termelő enzimek második osztályát azonosították a VIP 1 élesztőfehérje (más néven PP-IP 5K) formájában, amely képes átalakítani az IP 6-ot IP 7-re és IP 8 7,8-ra.

Az inozitol-pirofoszfátok számos eltérő sejtes folyamatot szabályoznak, mint például az inzulin szekréciója 9, a telomer hossza 10,11, a kemotaxis 12, a vezikuláris kereskedelem 13, a foszfát homeosztázis 14 és a HIV-1 gag felszabadulás. Két hatásmechanizmust javasoltak a molekulák ezen osztályára. Alloszterikusan befolyásolhatják a sejtek működését, ha kölcsönhatásba lépnek bizonyos fehérjékkel, például az AKT 16-mal. Alternatív megoldásként a pirofoszfátcsoport adományozhat foszfátot a foszforilezett fehérjékhez 17. Ennek a kutatási területnek a hatalmas potenciálját gátolja az inozitol-pirofoszfátok kereskedelmi forrásának hiánya, ami sok tudóst megakadályoz abban, hogy tanulmányozza ezeket a molekulákat és ezt az új transzláció utáni módosítást. Az inozitol-pirofoszfátok izolálásának jelenleg rendelkezésre álló módszereihez kifinomult kromatográfiás berendezés szükséges 18,19. Ezek az eljárások kihasználják azokat a savas körülményeket, amelyek inozitol-pirofoszfát lebontásához és ezáltal a rossz helyreállításhoz vezethetnek. Emellett az oszlop utáni sótalanító nehézkes eljárások csak speciális laboratóriumokra korlátozzák használatukat.

Ebben a tanulmányban igénytelen módszert írunk le az IP 6-kináz és a PP-IP 5-kináz reakció termékeinek előállítására, izolálására és tisztítására. Ezt a módszert a poliakrilamid gélelektroforézis (PAGE) azon képessége tette lehetővé, hogy erősen foszforilezett inozitol-polifoszfátokat oldjon 20. Az IP 6 K1 és PP-IP 5 K enzimatikus reakciók után, az IP 6-ot szubsztrátként alkalmazva, PAGE-t használtunk a keletkezett inozitol-pirofoszfátok elválasztására, amelyek ezt követően vízben eluálódtak.

Jegyzőkönyv

1. Enzimatikus reakció - 1. nap (1 óra délután)

  1. Az első lépés 10-20 független enzimatikus reakció előkészítése, amelyekben az IP 6 K1 vagy VIP1 átalakítja az IP 6-ot, a pirofoszforilezett izoformákat.
  2. E. coli-ból tisztított His-IP 6 K1 és GST-VIP1 enzimeket használunk a korábban leírt protokoll szerint 17,18.
  3. Készítsen elő 50 μl reakciót 1x reakciópufferrel (30 mM Hepes, pH 6,8, 50 mM NaCl, 6 mM MgSO 4, 1 mM DTT), 6 mM foszfokreatinnal (PCr), 25 U/ml kreatin-fosfoKinázzal (CPK), 5 mM ATP-vel. (Mg só), 0,3 mM IP6, 0,05-0,1 ug His-IP 6 K1 vagy GST-VIP1. A hangerő beállítása a MiliQ ddH 2 O segítségével.
  4. Röviden forgassa el a reakciót, és forgatás közben egy éjszakán át 37 ° C-on.

2. Poliakrilamid gél kiöntése és betöltése - 2. nap (délután 4 óra)

  1. A poliakrilamid gélt 24 cm hosszú, 18 cm széles üveglemezek és 1,5 mm széles távtartók segítségével készítik. Általában 16 sávos vagy előkészítő egy sávos fésűt használnak.
  2. Készítsen elegyet (50 ml/gél) a következő tartalommal: 35,5% (w/v) akrilamid: biszakrilamid 19: 1, 1x trisz/borát/EDTA (TBE), 0,05% (w/v) ammónium-perszulfát (APS), TEMED 0,05% (w/v). Öntsük az elegyet az előre öntött üveglemezek közé, helyezzük be a fésűt és hagyjuk 30-60 percig polimerizálni szobahőmérsékleten.
  3. Miután a gél polimerizálódott, helyezze át az eszközöket hűtőszekrénybe, és 1X TBE-ben kb. 30-60 percig 200-300 voltos adagolással.
  4. Adjon minden reakcióhoz 1X OrangeG festéket (10 mM Tris-HCl, pH 7,0, 1 mM EDTA, 30% glicerin, 0,1% OrangeG). Készítsen elő egy mintát 2 nmol IP 6-tal standard kontroll terhelésként.
  5. Fecskendővel és 21G-os tűvel alaposan mosson meg minden mélyedést futtató pufferrel a csapadék eltávolításához, majd töltse be a gélt. Kerülje a terhelést a kút oldalán.
  6. Futtassa a gélt egy éjszakán át 450-550 V (7 MAMP/gél) sebességgel, amíg az OrangeG festéksáv az utolsó 10 cm-en belül van a gél aljától.

3. Az IP 7 izolálása - 3. nap (4 óra) és 4. nap (6-7 óra SpeedVac szárítás)

  1. Szedje szét a gél készüléket, és óvatosan vegye ki az egyik üveglemezt, és hagyja a gélt a másik tetején. Vágja le a gél egy kis részét közvetlenül az alján lévő OrangeG festékszalag fölött, az IP-6 szabvány és a minta nyomának megfelelően. 1. ábra Látható.
  2. Festse a gél kivágott részét toluidinkékkel (0,1% (w/v) toluidinkék, 20% (w/v) metanol, 2% (w/v) glicerin) néhány percig (1-3 percig) vagy tovább megjelenik az inozit-pirofoszfát-szalag. Az üveglapot előzetesen tegye vissza a gél tetejére, hogy megakadályozza a festetlen gél kiszáradását.

Az IP-7 sávnak láthatónak kell lennie, mivel kicsit lassabban fut, mint az IP-6 szabvány. Az IP 6-nál gyorsabban futó ATP-nek is láthatónak kell lennie (1. ábra). Tegye a gél festett részét egy festésmentes oldatba (20% (w/v) metanol) néhány percre, mossa le a felesleges toluidinkéket, és helyezze a gélt a nem festett géllel.

Ha a magasabb pirofoszforilezett inozit-izoformák (IP 8 és IP 9) vizualizációjára van szükség, festse a gélt toluidinkék festőoldattal 20 percig szobahőmérsékleten. Ezután mossa a toluidinkéket a festékmentesítő oldattal körülbelül 15 percig.

4. Az IP 7 koncentráció és tisztaság meghatározása.

  1. Használjon 2-5 μl visszanyert IP 7 mintát PAGE gélfuttatáson, hasonlóan a 2.2-2.5. Szakaszhoz. Tegyen többféle IP 6-os hígítást (azaz 0,5, 1, 2, 4 nmol) koncentráció standardként és 4 nmol poli-P markert. A gél futtatása után vizualizálja az inozitol-pirofoszfát izoformákat úgy, hogy a teljes gélt festékkel és festékkel távolítja el toluidinkék oldattal a 3.2. Szakaszban leírtak szerint. (2A. Ábra) leírták.
  2. Toluidinnal történő festés után a koncentrációkat meghatározhatjuk a gél beolvasásával és az IP 6 és IP 7 közötti intenzitásbeli különbségek összehasonlításával olyan képalkotó szoftver segítségével, mint: B. Image-J, mint a 2B. Ábra Látható.

5. Reprezentatív eredmények:

Az IP 6-ból 7-be történő preparatív enzimatikus átalakulása az IP IP 6 K1 és VIP1 enzimeken keresztül könnyen orvosolható PAGE-analízissel (1. ábra). Az IP 6 méretkontrollként történő betöltése a toluidinkék gél festéssel együtt lehetővé teszi a pirofoszforilezett származékok azonosítását, mivel ezek lassabban futnak, az inozitol gyűrű foszfátcsoportjainak számától függően. A fent leírt módszer lehetővé teszi az IP 7 egyszerű tisztítását. A tisztított inozit-pirofoszfát PAGE-val történő elemzése megmutatta az IP 7 tisztaságát. (2A. Ábra). Érdekes módon az VIP 7 IP termék 1/3PP-IP 5 izomerje valamivel lassabban vándorol, mint az IP 6 K1 által generált IP 7 5PP-IP 5 izomerje. Az IP 6 szabványok használata lehetővé teszi a tisztított IP 7 koncentrációjának egyszerű számszerűsítését (2B. Ábra). Mielőtt további kísérletekhez alkalmazná az IP 7-et, fel lehet mérni annak biológiai aktivitását
(3. ábra). Az 5PP-IP 5-et VIP1-gyel és az IP 7-foszfatáz DDP1-vel (difoszfoinozitol-polifoszfát-foszfohidroláz) inkubáljuk. A VIP1 megtisztított IP 7-től IP 8-ig és a DDP1 IP 6-tól rendszeresen megtisztítják (3. ábra) megtért.

minőségi
1. ábra:. Toluolidin festés PAGE-val és az IP 7-Band-Der izolálása A standard (IP 6) gélrészeket levágtuk és toluidinkék oldattal festettük. A három sáv (felülről lefelé) IP 7, IP 6 és ATP. A gél festett részét ezután a gél fennmaradó részéhez igazítottuk. Ez lehetővé teszi a gél IP 7-es részének lokalizálását, amelyet ezután levágnak és megtisztítanak (szaggatott doboz).

minőségi
2. ábra: IP 6 K1 és VIP1 reakciótermékek PAGE elemzése. A) Az IP 6 (4, 2, 1, 0,5 nmol) elemzését toluidinkék festéssel alkalmaztuk mind az IP 6 K1 (5PP-IP 5), mind a VIP1 (1/3PP-IP tisztított 5) IP 7 koncentrációjának meghatározására. ) Reakciók. B) Scatter diagram elemzés a tisztított IP 7 koncentrációjának meghatározására. A koncentrációkat a sávintenzitásnak megfelelően határoztuk meg, az ImageJ szoftverrel számolva, összehasonlítva az előzőleg meghatározott IP 6 mennyiségekkel. Az X tengely az intenzitásokat, az Y tengely a nmol-ban kifejezett koncentrációkat jelenti.

protokolljának
3. ábra: Az IP 7 biológiai aktivitásának elemzése A tisztított IP 7 minőségének meghatározása érdekében 5PP-IP 5-t (IP 6 K1 által generált IP 7) inkubáltunk VIP1-gyel vagy IP 7-foszfatáz DDP1-gyel, majd úgy döntöttünk, hogy reagálunk a PAGE-ra. A DAPI és toluolidin festés megmutatta az IP 8 várható termelését a VIP1 által, és az IP 7 átalakulását IP 6vá a DDP1 által.

Vita

Az inozitol-pirofoszfát biokémiai felhasználását erősen korlátozza az ilyen vegyületek kereskedelmi forgalomban való hiánya és a meglévő detektálási módszerek alacsony érzékenysége. A PAGE kombinációja, amely lehetővé teszi a különböző számú foszfátcsoportot tartalmazó molekulák és a toluidinkék elválasztását (1. ábra), a foszfátcsoportokat megkötő metakromatikus festék lehetővé teszi az inozitol-pirofoszhát-izoformák könnyű felismerését, új utakat nyitva a kutatásban 20.

A PAGE technológia leírása az inozitol-pirofoszfátban az enzimreakció termékeinek megtisztítására, akár az IP 6 K1, akár a VIP1 révén, egyszerű, gazdaságos és megbízható módszer, amely lehetővé teszi nagy mennyiségű, kiváló minőségű IP 7 előállítását. A fent leírt módszer nem korlátozódik az IP 7 egyszerű tisztítására, de a leírt protokoll kisebb módosításai lehetővé tehetik az inozitol-pirofoszfátok különböző tartományának tisztítását. A magasabb foszforilezett inozitol-pirofoszfát izoformák, több mint nyolc foszfátcsoporttal, jobban detektálhatók IP 7 vagy más mennyiségű IP 6 alkalmazásával, mint a 20.6 szubsztrát. Ez az inozit-pirofoszfát a szín hosszának növelésével kimutatható, majd tisztítható (3.2. Szakasz). Ezenkívül az IP 5 alkalmazása az enzimatikus reakció szubsztrátjaként lehetővé tenné a PP-IP 5 és más inozitol-pirofoszfátok tisztítását az inozitol gyűrű hidroxilcsoportjával.

Ennek eredményeként ez az igénytelen módszer lehetővé teszi az inozitol-pirofoszfát milligrammnyi mennyiségének megbízható tisztítását széles körben elérhető eszközökkel, és ezáltal új utakat nyit meg ennek az izgalmas kutatási területnek.

Közzétételek

Nem jelentettek be összeférhetetlenséget.

Köszönetnyilvánítás

Köszönjük A. Ricciónak a hasznos hozzászólásokat és a kézirat elolvasását. Ezt a munkát az Orvosi Kutatási Tanács (MRC) által a Sejtbiológiai Egység finanszírozása és az Emberi Határtudományi Program támogatása (RGP0048/2009-C) támogatta.