Stéphanie Robert PhD értekezés a növénybiológiából - PDF ingyenes letöltés
A sejtszintű anyagcsere irányított elterelése vaddohányban A klinikai érdeklődésű fehérjék heterológ expressziójának gazdaszervezetként használt Nicotiana benthamiana tézis Stéphanie Robert Doktor a növénybiológiai filozófia doktor (PhD) Quebec, Kanada Stéphanie Robert, 2015
Végül, de nem utolsósorban: köszönöm férjemnek, Stéphane-nek a támogatást és a szeretetet mindezen esték, éjszakák és hétvégék ellenére, hogy dolgozzanak, néha kétségbeesve, de soha nem engedve. Stephanie x
Stéphane-nek és Zachary-nak, xi
Tartalomjegyzék Összefoglaló. iii Kivonat. v Előszó. vii Köszönetnyilvánítás. ix Tartalomjegyzék. xiii táblázatok listája. xvii Ábra lista. xix Rövidítések listája. xxi Általános bevezetés. 1 1. fejezet. 3 Irodalmi áttekintés. 3 1.1 Rekombináns fehérjék termelése. 5 1.1.1 Hagyományos termelési rendszerek. 5 1.1.1.1. Baktériumok. 5 1.1.1.2 Élesztők. 6 1.1.1.3. Állati sejtek. 6 1.1.1.4 Tojás. 7 1.1.2 Növényi molekuláris kultúra: hatékony alternatíva a rekombináns fehérjék előállításához. 7 1.1.2.1 Növényi sejtek transzfekciója. 8 1.1.2.2. Stabil transzformáció, tranziens kifejezés. 9 1.2 Proteolízis, amely gyakran gátja a növényi molekuláris gazdálkodás kielégítő hozamának. 11 1.2.1 Rekombináns fehérjék instabilitása a planta-ban. 11 1.2.2 Szenzencia és proteolízis. 12 1.3 Stratégiák a rekombináns fehérjék védelmére a növényi molekuláris gazdálkodásban. 13 1.3.1 Rekombináns fehérjék stabilizálása ex planta. 13 1.3.2 Rekombináns fehérjék stabilizálása planta-ban. 14 xiii
4.5.8 proteázvizsgálatok. 74 4,5,9 C5-1 mennyiségi meghatározás. 75 4.5.10 Statisztikai elemzések. 75 4.6 Eredmények és vita. 75 4.6.1 A MeJA levél-proteom egyensúly helyreállítását indukálja az N. benthamiana-ban. 4.6.2 A MeJA kevéssé befolyásolja az N. benthamiana A. tumefaciens kölcsönhatását. 4.6 4.6.3 A MeJA szintén csekély hatással van a transzfektált levelek proteáz aktivitására. 80 4.6.4 A MeJA kezelés növeli az átmenetileg expresszált rekombináns fehérje felhalmozódását 83. 84 4.7 Következtetések. 85 4.8 Köszönetnyilvánítás. 86 4.9 Támogató információk. 86 5. fejezet. 95 Következtetések és perspektívák. 95 5.1. Vissza a hipotézisekhez. 97 5.1.1 1. fő hipotézis, a levélfejlődés stádiumának a C5-1 antitest hozamára gyakorolt hatásáról. 98 5.1.2. 2. fő hipotézis a gazdanövény védekezési útjának a C5-1 antitest hozamára gyakorolt hatásáról. 99 5.2. Következtetésképpen. 101 Hivatkozás. 103 Melléklet. 125 Könyvfejezet. 125 xvi
Táblázatok 3. fejezet 3.1. Táblázat: C5-1 hozam (µg) levélenként és növényenként N. benthamiana növényekben, amelyek átmenetileg expresszálják a C5-1 önmagában vagy a C5-1-et SlCys8-mal vagy SlCDI-vel. 48 S3.1. Táblázat: Az N. benthamiana teljes levél- és apoplasztikus kivonataiban a proteolitikus aktivitás (egység/mp) az üres vektort tartalmazó Agrobacteriumokkal, vagy a C5-1 expressziós vektort tartalmazó vagy nem fertőzött Agrobacteriumokkal való beszivárgás után hat nappal távozik. 57 4. fejezet 4.1. Táblázat: A stresszhez kapcsolódó fehérjék fokozottan szabályozottak a N. benthamiana-ban 7 nappal a meja-kezelés után. 78 S4.1. Táblázat: Az 1. táblázat kiegészítése: A N. benthamiana-ban felfelé szabályozott stressz-szabályozott fehérjék párosított egyedi peptidjei 7 napos poszt-meja kezelést eredményeznek. 88 S4.2. Táblázat: Valós idejű RT PCR-vizsgálatokhoz használt előre- és reverz oligonukleotid-primerek. 93 xvii
Az ábrák felsorolása 1. fejezet 1.1. Ábra A transzformációhoz használt Ti plazmid (A), egy tipikus bináris vektor (B) és egy "segítő" plazmid (C) sematikus ábrázolása. Pacurar és mtsai., 2011. 10 1.2. Ábra A C5-1 rekombináns antitest könnyű és nehéz láncainak stabilizálása az SlCDI-t vagy az SlCYS9-et átmenetileg expresszáló Nicotianana benthamiana agro-infiltrált leveleiben. 18 1.3. Ábra Keresztkapcsolat a növényekben indukált szisztémás rezisztenciában részt vevő metabolikus utak, a szalicilsavfüggő (SA) és a jázmonsavfüggő (JA) út között. 21 3. fejezet 3.1. Ábra: C5-1, SlCYS8 és SlCDI expresszió bináris vektorai. 40 3.2. Ábra Az N. benthamiana levél biomasszájának jellemzése 44 3.3 ábra Az N. benthamiana levelek fő proteolitikus aktivitása 46 3.4. Ábra A ko-expresszált SlCYS8 vagy SlCDI hatása a C5-1 felhalmozódására. 49 3.5. Ábra A C5-1 önmagában vagy az SlCYS8-mal vagy az SlCDI-vel együtt expresszált biológiai aktivitása. 53 S3.1 ábra A C5-1 aktivitási szintjei a levélkor gradiens mentén. 58 xix
Rövidítések listája AACT ADN; DNS cDNS; cdna T-DNS; T-DNS ADP ANOVA RNS; RNS mRNS; mrna BTH CaMV CHO ELISA EV Fab HC HCl Ig JA LC MeJA MES NaCl nos WHO PBS PCR PDI PR RuBisCO RE; ER RSA a1-antichimotripszin humán dezoxiribonukleinsav; dezoxiribonukleinsav komplementer DNS; komplementer DNS-transzfer DNS; transzfer DNS adenozin-difoszfát varianciaanalízis; varianciaanalízis Ribonukleinsav; ribonukleinsav hírvivő RNS; hírvivő RNS Benzotiadiazol karfiol mozaik vírus Kínai hörcsög petefészek sejtek Enzimhez kötött immunszorbens vizsgálat Kísérleti infiltráció üres vektorral Töredék antigénkötő Nehéz lánc (nehéz lánc) Hidrogén-klorid (hidrogén-klorid) Immunglobulin Jazmonsav (jázonsav) Könnyű lánc (könnyű lánc) ) Metil-jazmonát (metil-jazmonát) 2- [N-morfolino] etánszulfonsav Nátrium-klorid (nátrium-klorid) Nopalin-szintáz Egészségügyi Világszervezet Foszfáttal pufferolt sóoldat Polimeráz láncreakció (polimeráz láncreakció) Fehérje-diszulfid-izomeráz Patogenezishez kapcsolódó (fehérje) Ribulóz- 1,5-biszposfát-karboxiláz/oxigenáz Endoplazmatikus retikulum; endoplazmatikus retikulum Szerzett szisztémás ellenállás xxi
RIS indukált szisztémás rezisztencia SA Szalicilsav (szalicilsav) ScFv Egyláncú variábilis fragmens SD Szórás SDS-PAGE Nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gél elektroforézis SE Standard hiba (standard hiba) SlCDI Paradicsom-katepszin D inhibitor; Solanum lycopersicum cathepsin D inhibitor SlCYS8 paradicsom multicisztatin nyolcadik alegysége; Solanum lycopersicum multicystatin nyolcadik alegység SlCYS9 Tomato cystatin no. 9; Solanum lycopersicum Cystatin 9 SP Jelpeptid (szignálpeptid) TEV Dohánymaró vírus TMB 3,3,5,5 -tetrametilbenzidin xxii