Synevo Moldova C-genotipizáló hepatitis vírus
Általános információk és ajánlások
A többi RNS vírushoz hasonlóan a HCV nukleotid szinten is jelentős genetikai sokféleséggel rendelkezik, amelyet a vírusmutációk magas aránya generál. Ennek a genetikai sokféleségnek a bizonyos módon történő strukturálása érdekében a genomiális szekvencia filogenetikai elemzése alapján 6 genotípusban (1, 2, 3, 4, 5, 6) HCV osztályozást fogalmaztak meg. Minden genotípus viszont filogenetikailag fel van osztva egy vagy több altípusra (úgynevezett a, b, c stb.). Ezek a nevek lettek a HCV genotípusok 10; 11 új nomenklatúrájának szabványos rendszere. Ezenkívül a HCV-fertőzöttek különféle víruspopulációk keverékeként viselkednek, és kvázifajoknak nevezik magukat.
A 6 fő genetikai típus nukleotidszekvenciákban 30-35% -ban különbözik egymástól; az altípusok között 20-25% -os különbség van, és ugyanazon altípuson belül legfeljebb 10% -os különbség van.
A HCV genom olyan doménekből áll, amelyek nagymértékben különböznek a mutációk sebességétől és a nukleotidszekvenciák variálhatóságától. Így a nem lefordított régió a genom 5'-végén (5'UTR) a legjobban fennmaradt domén, a leglassabb evolúciós sebességgel. Ezután következik a fehérje nukleokapszid magot kódoló C (mag) gén, amely háromszor gyorsabban fejlődik az 5'UTR régióhoz képest. Az E1 és E2 burokfehérjéket kódoló gének alkotják a hipervariábilis régiót, amely izolátumokonként eltérő. Ez lehetővé teszi a vírus számára, hogy megkerülje a gazdaszervezet immunmechanizmusait, amelyek a vírus burkolatában lévő hozzáférhető fehérjék ellen irányulnak.
A HCV genotípusok és altípusok a földrajzi eloszlás, a relatív prevalencia és a fertőzés átviteli módjainak összetett mintáit mutatják be, amelyek jobban megérthetők, ha három csoportba sorolják őket:
1. A járványcsoport az 1a, 1b, 2a, 2b és 3a altípusokat foglalja magában, amelyek világszerte elterjedtek és felelősek a legtöbb fertőzésért világszerte. Ezen altípusok gyors globális terjedése a fertőzött vérkészítményeken keresztül történő hatékony továbbadásukból és az intravénás gyógyszerek beadásából adódik. Az 1b és 2a altípusok túlnyomórészt a vérkészítményeken keresztül történő átvitelhez kapcsolódnak, és relatív prevalenciájuk az utóbbi években a javított donorszűrés miatt csökkent. Az 1a. És a 3a. Altípus főleg a drogosoknál fordul elő, és elterjedésük növekszik.
2. az endémiás csoport eloszlása alacsonyabb, mint a járványcsoport, és bizonyos régiókra korlátozódik. Például a 6-os genotípus altípusok csak Délkelet-Ázsiában találhatók. Az endémiás törzsek nagyon magas genetikai sokfélesége a fertőzés hosszú távú fennmaradására utal ezekben a régiókban, a viszonylag nem hatékony átviteli módok fenntartása miatt, beleértve a szexuális.
3. A helyi járványcsoport nagy előfordulással rendelkezik a földgömb bizonyos régióiban és populációiban. Így a 4a altípus felelős Egyiptom népességének több mint 10% -ának megfertőzéséért, és ritkán fordul elő a Közel-Keleten kívül. Epidemiológiai vizsgálatok szerint ez a jelenség a huszadik században, a schistosomiasis elleni gyógyszerek tömeges intravénás beadása során fordult elő 11 .
Hazánkban az 1b genotípus, valamint az 1a és 1b 4 genotípus keveréke dominál. Egy nemrégiben a bukaresti Matei Bals Intézetben végzett, 670 betegen végzett vizsgálat az 1-es genotípusú HCV 99,7% -os prevalenciáját mutatta 6 .
A vírus genotípusának ismerete prognosztikai értékkel szolgál a krónikus vírusos HCV hepatitisben szenvedő betegek terápiájának hatékonyságáról. Például az 1b genotípus (leggyakrabban poszttranszfúzió után szerzett) rossz kezelési reakcióval, valamint a cirrhosis és a hepatocellularis carcinoma fokozott kockázatával jár. Másrészt a 2. és 3. genotípus (főként iv. Drogfogyasztás révén szerzett) a vírusellenes terápiára adott kedvező válaszhoz kapcsolódik; 7; 8; 9 .
Az Egyesült Államok Nemzeti Egészségügyi Intézete (NIH) 2002-ben kimutatta, hogy a HCV genotípusok meghatározása fontos az interferon és a ribavirin optimális dózisának, valamint a kezelés időtartamának megválasztásában. Tehát vad típusú 1 genotípusú betegeknél a kezelés időtartama 48 hét, a 2. és 3. genotípusú betegeknél pedig 24 hét, alacsonyabb ribavirin dózisokkal. Hasznos, ha a HCV genotipizálását minden C vírusfertőzésnél el kell végezni a kezelés megkezdése előtt 1 .
A laboratóriumunkban elvégzett teszt PCR technikát alkalmaz a HCV genom egyes régióinak amplifikálására, majd reverz hibridizációval azonosítják az 1-6 genotípusú HCV genotípusokat, valamint az 1 genotípus a és b altípusait 5 .
Az 5'UTR régió több, az egyes genotípusokra specifikus szekvenciát mutat be, amelyek kicsi változó régiók mentén vannak elosztva, amelyek pontos információkat nyújthatnak az 1-5. Genotípusról, valamint a 6. genotípus a és b altípusairól. A nagy szekvenciális hasonlóság miatt a 6. genotípus alklipjei ( korábban 7, 8, 9 és 11 osztályba sorolták) csak az 5'UTR régió elemzésével lehet megkülönböztetni az 1. genotípustól. Az 1a és 1b altípus azonosításának pontossága az 5'UTR régió elemzésével 80% és 95% között van, és a vizsgált specifikus izolátumoktól függ 3. Tesztünk a mag régió szekvenciáit használja az 5'UTR régióval együtt a 6-os, c-1 genotípus azonosítására. Az 1a és 1b altípus azonosításának pontosságának javítása érdekében további mag génszekvenciákat is tartalmaznak. .
Betegképzés - nincs szükség speciális képzésre 5 .
Begyűjtött minta - vér jön 5 .
Betakarítási konténer - EDTA-t antikoagulánsként tartalmazó vakutainer 5 .
Betakarított mennyiség - amennyit a vákuum megenged 5 .
Az elutasítás okai megpróbálni - heparin antikoagulánsként történő alkalmazása; koagulált vagy hemolizált minták 5 .
Tesztstabilitás - Az EDTA-vér stabil 48 óra 2-8ºC-on 5 .
Módszer - láncpolimerizációs reakció, amelyet reverz hibridizáció követ; a biotinilezett amplifikációs termék egy hibridizációs folyamaton megy keresztül, amely nitrocellulóz-csíkhoz kapcsolt 5'UTR és különböző HCV genotípusok magrégióira specifikus oligonukleotidszondákat használ; a hibridizációs lépés után hozzáadjuk a konjugátumot (alkalikus foszfatázzal jelölt streptavidin), amely a biotinilezett hibridhez kapcsolódik; a hozzáadott kromogén szubsztrát végül reagál az alkáli sztrepatvidin-foszfatáz komplextel, és barnás-lila csapadékot képez, amelyet szalagsávként jelenítenek meg; az eredmények értelmezése egy kártya segítségével történik 5 .
Határértékek és interferenciák
A HCV genotipizálása nem ajánlott a HCV fertőzés szűrésére vagy megerősítésére. A teszt csak 600 NE/ml virémia esetén lehetséges.
Egyes esetekben értelmezhetetlen eredmények érhetők el a HCV genomszekvenciák heterogenitása, a vegyes fertőzések vagy a rekombináns HCV törzsek (ritka) létezése miatt .
1. Az AASLD gyakorlati útmutatói: http: /www.aasld.org/pdffiles/Prac._Guide_Hep_C
2. Konszenzusos konferencia a hepatitis C. kezeléséről. Maison de la Chimie, Párizs, Franciaország, 2002. február 27–28. Agence Nationale d „Accreditation et d” Evaluation en Sante (ANAES).
3. Chen Z, Weck KE. Hepatitis C vírus genotípusának meghatározása: az 5 ’nem lefordított régió lekérdezése nem tudja pontosan megkülönböztetni az 1a és 1b genotípusokat. In J Clin Microbiol. 2002; 40: 3127-3344.
4. Ileana Constantinescu, Fundeni Klinikai Intézet. A hepatitis vírusok genotipizálása Romániában. Szimpózium, 2008. június, Tg. Mures: A molekuláris biológiai technikák szerepe a hepatitis C vírusfertőzés mechanizmusainak felderítésében, valamint a fertőzéssel összefüggő fibrózis és hepatocelluláris carcinoma új markereinek felfedezésében.
. 5. Synevo Laboratórium. Az alkalmazott munkatechnológia konkrét hivatkozásai. 2009. Ref Típus: Katalógus.
6. Neaga Emil. A HCV 1 genotípus előfordulása Romániában. Szimpózium, 2008. június, Tg. Mures: A molekuláris biológiai technikák szerepe a hepatitis C vírusfertőzés mechanizmusainak felderítésében, valamint a fertőzéssel összefüggő fibrózis és hepatocelluláris carcinoma új markereinek felfedezésében.
7. Nguyen MH, Keeffe EB. A hepatitis C vírus 4,5 és 6 genotípusának elterjedtsége és kezelése. In Clin Gastroenterol Hepatol. 2005; 10: S97 - S101.
8. Pawlotsky JM. A hepatitis C vírus genetikai variabilitása: patogén és klinikai következmények. A Clin Liver Dis. 2003; 7; 45 - 66.
9. Seeff LB, Hoofnagle JH Függelék: Az Országos Egészségügyi Intézet konszenzus-fejlesztési konferenciája: A hepatitis C kezelése 2002. In Clin Liver Dis. 2003; 7, 261-287.
10. Simmonds P, Bukh J, Combet C és mtsai. Konszenzusos javaslatok a hepatitis C vírus genotípusainak egységes nómenklatúrájáról. Hepatol-ban. 2005; 42; 962 - 973.