Tandem folyadékkromatográfia; Tömegspektrometrián alapuló megközelítés a

Összegzés

Itt leírjuk a Staphylococcus aureus anyagcseretermékeinek extrahálásának protokollját, és ezek későbbi elemzését folyadékkromatográfiával és tömegspektrometriával.

Absztrakt

Bevezetés

A bakteriális kórokozók számos kihívással néznek szembe a befogadó környezetben. Az immunsejtek közvetlen támadása mellett a gazdaszervezet a baktériumok túlélése és szaporodása szempontjából fontos tápanyagokat is kiválasztja, táplálkozási immunitást generálva 1, 2. Ezeknek az ellenséges környezeteknek a túlélése érdekében a bakteriális kórokozók virulencia faktorokat valósítanak meg. Ezen tényezők közül néhány felhasználható a baktériumok immunválaszának elkerülésére; Egyéb tényezők az emésztési enzimek, például a hialuronidáz, a termonukleáz és a lipáz, amelyek lehetővé teszik a baktériumok számára a szövetből származó 3., 4., 5. komponensből hiányzó tápanyagok pótlását. Valójában a baktériumok olyan szabályozó rendszereket fejlesztettek ki, amelyek a sejt fiziológiai állapotát a virulencia faktorok 6, 7, fel> 8, 9, 10 termeléséhez kötik.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Jegyzőkönyv

1. Pufferoldatok készítése

  1. Készítsen foszfáttal pufferolt sóoldatot (PBS; pH 7,4) úgy, hogy 10 × PBS törzsoldatot 1x végkoncentrációra hígít ultratiszta (desztillált és ioncserélt) vízzel.
  2. Az oltóoldatot 2 ml acetonitril, 2 ml metanol, 1 ml ultratiszta H20 és 19 μl (0,1 mM végkoncentráció) hangyasav elegyítésével készítjük.
  3. Készítsünk LC-MS A oldószert hangyasav (0,2% [v/v] végkoncentráció) hozzáadásával az ultratiszta vízhez.
  4. Készítsünk LC-MS B oldószert hangyasav (0,2% [v/v] végkoncentráció) acetonitrilhez való hozzáadásával.
    MEGJEGYZÉS: Minden oldatot a lehető legtisztább reagensekkel kell elkészíteni (általában HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY fokozatú). Az oldatokat minden kísérlet előtt frissen kell elkészíteni, és felhasználás előtt jégen kell tárolni.

2. Az egyensúlyi állapotú S. aureus növekedés megállapítása

  1. Fagyasztott glicerin törzsoldatból izolált triptikus szójaagaron (TSA) érdekelt S. aureus törzsek. Inkubáljuk 37 ° C-on 16-24 órán át.
  2. 4 ml triptikus szójalevest (TSB) vagy más megfelelő táptalajt oltunk be steril üveg inkubációs csövekbe, mindegyik törzs egyes telepeivel. Inkubálni ferde (

70 ° -os szög) 60 fordulat/perc fordulat mellett (rpm) 37 ° C-on 16-20 órán át.
MEGJEGYZÉS: Az éjszakai tenyészetek hajlamosak az oxigén gradiensre, ha a szokásos eljárások, beleértve a 2.2. Lépésben leírtakat is, befolyásolják a sejtfiziológiát. Tehát többszörös visszahígítási stratégiát alkalmazunk a biológiai egyensúlyi állapot biztosításához (lásd alább a 2.4-3.2. Lépéseket).

  • Spektrofotométer segítségével mérjük meg a 2.2. Lépésből származó tenyészetek optikai sűrűségét 600 nm-en (OD 600). Használjon steril közeget optikai referenciaként (üres). Ezeket a sejteket 0,05 OD 600-ra hígítjuk 50 ml steril (37 ° C-ra előmelegített) TSB táptalajban, külön 250 ml-es DeLong palackokban.
  • Inkubálja be a tenyészeteket 37 ° C-on, vízfürdőben, rázással 280 fordulat/perc sebességgel.
  • 30 percenként végezzen OD 600 méréseket; az optikai sűrűség növekedésével szükség lehet a tenyészetek TSB-vel való hígítására, hogy azok a spektrométer lineáris abszorpciós tartományán belül maradjanak.
  • Ha a 2.5. Lépésből származó tenyészetek OD 600 értéke

    Érje el a 0,8-1,0 értéket, szubkultúrázza őket 50 ml 37 ° C-on TSB-n 0,01-0,05 OD600 értékig, és ismételje meg a 2.4 és 2.5 lépéseket.

    0,4-0,5, szerológiai pipettával távolítsunk el 13 ml tenyészetet a lombikból, és vigyük a mintát a szűrőkre.

  • Miután a teljes mintát leszűrtük, azonnal mossuk le a szűrőt ≥5 ml jéghideg PBS tápközeggel társult metabolitokkal.
  • Engedje el a vákuumot, és egy steril csipesszel távolítsa el a szűrőt a fritből. Fordítsa meg a szűrőt (cellával lefelé) az előre lehűtött hűtőoldatban.
    MEGJEGYZÉS: Fontos, hogy a fenti lépéseket gyorsan (azaz másodperceken belül) és olyan gyorsan elvégezzük, hogy biztosítsuk a sejtek folyadékának gyors elrettentését, és megállítsuk az anyagcsere aktivitást.
  • Inkubálja a szűrőket az oltóoldatban száraz jégen ≥20 percig.
  • Steril csipesszel fordítsa meg a szűrőket (cellával felfelé) a Petri-csészében, és egy mikropipetta segítségével állítsa le az oltóoldatban lévő sejteket, hogy öblítse le a membránt.
  • reszuszpendáljuk a sejteket kioltó oldatban, majd helyezzük át a sejtszuszpenziót egy steril, 2 ml-es ütésálló csőbe

    100 µ L 0,1 mm-es szilícium-dioxid-gyöngy. Tárolja ezt száraz jégen vagy -80 ° C-on.

    1. A mintákat nedves jégen olvasztjuk fel, és helyezzük a sejteket homogenizátorba, négy sorozatban 30 másodpercig, 6000 fordulat/perc sebességgel, 2 perc száraz jégen történő hűtési periódusokkal, amelyek zavarják a ciklusokat.
    2. Tisztítsuk a lizátumokat 15 percig egy előre hűtött, hűtött mikrocentrifugában maximális sebességgel (azaz 18 213 xg ≤4 ° C-on).
    3. Vigye a felülúszót egy tiszta reakciócsőbe.
    4. Mikropipetta segítségével vigyük át a minta egy kis részét egy mikrocentrifuga-csőbe a maradék peptidtartalom mennyiségi meghatározásához a 6. lépésben; A többit -80 ° C-on tároljuk.
      MEGJEGYZÉS: A fenntartott minta mennyisége a 6.1 lépésben leírt BCA vizsgálattól függően változik. Ezt a mintát nedves jégen kell tárolni azonnali elemzés céljából, vagy -80 ° C-on kell fagyasztani.

    6. Bicinchoninic Acid (BCA) teszt

    1. Végezzen el egy BCA-vizsgálatot a készlet gyártójának ajánlása szerint, az 5.4 lépésben szereplő minták felhasználásával, hogy meghatározza az egyes minták maradék peptid-koncentrációját.

    8. Az ionszám korrekciója

    1. Jelölje meg az egyes mintákat referenciamintaként a kötegkorrekcióhoz (pl. Vad típus, 1. ismétlés).
    2. Számítsa ki a referencia minta összes metabolitjának ionszámának összegét. Ismételje meg ezt a számítást az összes mintára.
    3. Az arány létrehozásához osszuk el az egyes minták összes ionszámát a referencia minta teljes ionszámával.
    4. Osszuk el a mintában lévő egyes metabolitok ionszámát a minta/referenciaaránnyal, hogy minden egyes metabolitra vonatkozóan sok korrigált ionszámot kapjunk.

    1. Osztja meg a szakaszban korrigált ionszámokat minden, a 8. lépésben kapott mintánál a peptidkoncentrációval, amelyet a BCA assay-vel határoztak meg a 6. lépésben, hogy normalizált értéket kapjon az egyes metabolitokra.
      MEGJEGYZÉS: A 9.1. Lépésben az egyes metabolitok normalizált, tételenként korrigált ionszámát közvetlenül összehasonlíthatjuk a törzsek és egy statisztikai elemzés között (pl. Mann-Whitney U teszt). Alternatív megoldásként ismert, hogy egy metabolit változatlan lehet akár kezeléssel, akár genetikai háttérrel használható normalizáló eszközként a metabolitok bomlásával történő változások detektálására. Ismert mennyiségű L-norvalin vagy glurársav felvétele az extrakciós pufferbe felhasználható a minta feldolgozása során bekövetkező veszteség korrigálására 34.

    Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

    Reprezentatív eredmények

    Elemeztük az intracelluláris metabolikus termékkészleteket S. aureus-ban in vitro növekedés során, gazdag komplex közegben. Az elv bizonyítékaként összehasonlítottuk a metabolitprofilokat a meticillinre érzékeny S. aureus osteomyelitis izolált UAMS-1 (vad típusú [WT]) és egy olyan izogén törzs között, amelyből hiányzik a globális transzkripciós szabályozó CodY (Δ codY) 26. A WT és a codY törzsek állandó állapotú, exponenciális tenyészeteit TSB táptalajon hoztuk létre, a protokoll 2. lépésében leírtak szerint. A vad típusú és mutáns codY-null kultúrák növekedési viselkedése hasonló volt, csak kismértékű különbségek voltak a növekedés hozamában és sebességében (1. ábra). Az RNS-Seq és a microarray technológia használatával mi és más, az aszpartátból származó aminosavak bioszintézisében részt vevő enzimekért felelős gének visszaszorultak a mutált c-null codY-ban a WT sejtekhez képest az in - in vitro - növekedés a TSB-ben (2. ábra) Ezenkívül a 30, 35, valamint az elágazó láncú aminosavak permeazeit tartalmazó brnQ1 és brnQ2 túlzottan expresszálódnak a codY null mutánsban.

    Annak meghatározására, hogy a metabolitok egyensúlyi állapotban levő intracelluláris bősége milyen mértékben kapcsolódik ehhez a nullmutánsban megváltozott úthoz, LC-MS-alapú metabolit-profilozást végzünk. A WT és a codY-null mutáns sejteket biológiai egyensúlyi állapotra növesztettük, és a protokoll 4. lépésében leírtak szerint szkenneltük őket. Analitikai szoftvercsomag segítségével meghatároztuk a metabolitok bőségét az ionok intenzitásának csúcsterületén keresztül, minden egyes kromatográfiásan oldott metabolitintegrációhoz (lásd: Bill of Materials). Korrigáltuk az egyes minták maradék peptid-koncentrációjának metabolit-bőségével normalizált biomassza-különbségeket. Korrigáltuk ezeket az értékeket az egyes mintákban az összes metabolit esetleges szakaszos hatásai tekintetében, az átlagos ionszám kiszámításához és a vad típusú minta referenciaértékként történő felhasználásához. Ez a megközelítés lehetővé tette a minták közötti összehasonlítást a metabolitok rengetegségében az egyes körülmények között. Metabolitok közötti összehasonlítás egy adott mintán hasonló módon érhető el, ha először normalizáljuk a metabolitok mennyiségét az ionszámlálás során, standard addíciós moláris mennyiségek módszerével.

    Összehasonlítottuk a legfontosabb köztitermékek szintjét az aszpartát útvonalban az UAMS-1-ben és annak codY null mutánsában. Mint a 3 Amint látható, ennek az útnak a végtermékei (pl. Treonin és (izo) -leucin) a codY-null mutáns sejtekben, míg a prekurzorok (pl. Aszpartát és o-acetil-homoserin) a WT-sejtekben bőségesek. A BrnQ-permeázok 36 és az ILV bioszintetikus útjának együttes szabályozása valószínűleg az izoleucin és a leucin 30 növekedéséhez vezet. Bár a különbségek viszonylag kicsiek (RNS-Seq analízissel meghatározva, azt is meg kell jegyezni. DHP, 2,6-diaminoheptándioát ( 2,6-diaminopimelát).

    folyadékkromatográfia
    3. ábra: A metabolitok gyakorisága az aszpartátban - A család megváltozik egy codY mutánsban. Megmutatjuk a kiválasztott metabolitok log kétszeres változását a codY null mutánsban az UAMS-1-hez (WT) képest. A változást úgy határoztuk meg, hogy a codY-nulla biológiai törzs három replikátumának átlagos gyakoriságát elosztottuk a WT törzs három biológiai replikátumának átlagos bőségével. Az egyes metabolitok biológiai replikátumai közötti standard hiba előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

    Vita

    1,0, visszahígítva OD 600-ra

    0,05, tenyésztik és betakarítják, ha OD 600 -juk van

    0,5 elérte. Egy ilyen eljárás hígítja a citoplazmatikus molekulákat, beleértve a stabil RNS-eket is, miközben egy éjszakán át növekszik. Valójában az RNAIII, az agrokvorum-érzékelő rendszer effektora, egy ilyen RNS, és ugyanazok a géncélpontok expresszióját szabályozza, mint a CodY 25, 43, 44. A kumulatív RNSIII elfedheti a CodY-függő szabályozást, ami alulbecsüli a CodY általi elnyomás vagy stimuláció (Sharma és Brinsmade, publikálatlan eredmények).

    Ennek az elemzésnek korlátja, hogy pillanatnyi betekintést nyújt a sejtek anyagcseretermékeinek bőségébe; az eredményekből nem vonhatók le következtetések az adott útvonalon történő áramlás változásaira vonatkozóan. Például a lizin és a metionin mennyisége a két vizsgált törzs között nem változhat, annak ellenére, hogy a kódY-nulla szakaszon a bioszintetikus enzimek lebomlanak. (2 és 3). A codY-null törzs valójában több lizint és metionint képes előállítani, de gyorsan átalakulhat más vegyületekké; hogy ezek a molekulák ne halmozódjanak fel. 13 C vagy 15 N jelzett szén- vagy nitrogénforrások használata lehetővé tenné számunkra a szén- és nitrogénvázak követését a főbb metabolikus folyosókon keresztül 45, 46.

    A leírt eljárással magyaráztuk a metabolitkészletek változását a S. aureus, a B. subtilis 29, a Mycobacterium tuberculosis 47 és az Enterococcus faecium 48 esetében, azonban az eljárás alkalmazható más Gram-pozitív és Gram-negatív baktériumokra is, beleértve más emberi kórokozókat is könnyen termeszthető a laboratóriumban. Az információk metabolomikus és transzkripptikus integrációja váratlan kapcsolatokat tárhat fel az anyagcsere és a virulencia között, ami új stratégiákhoz vezethet a fertőzések kezelésére.

    Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

    Közzétételek

    A szerzők kijelentik, hogy nincsenek pénzügyi érdekeik.