A kulcs kalciumjel vált ki az eritrociták plazmodium inváziója során
Témák
Absztrakt
bevezetés
Itt monoklonális antitesteket (mAb) állítunk elő a PfRH1 (a P. falciparum 7 RH családjának egyik tagja) RII-3 eritrocita kötő régiója ellen. Megmutattuk, hogy a PfRH1 monoklonális antitestek blokkolják a merozoin inváziót, mivel specifikusan gátolják a kalcium jelátvitelt a parazitában, és nem közvetlenül zavarják a parazita eritrocita kötődését. Megmutatjuk továbbá, hogy ennek a kalcium jelzésnek a gátlása megakadályozza az EBA175 kisülését, és ezáltal megakadályozza a csomópontok kialakulását (ez egy kulcsfontosságú lépés, amely lehetővé teszi a parazita számára, hogy az aktin-miozin 3 motorja segítségével belépjen az eritrocitába). Eredményeink azt mutatják, hogy a PfRH1 és az EBA175 különálló funkciókkal rendelkezik, a PfRH1 kezdeti jelfelismerési és transzdukciós szerepet játszik, ami az EBA175 későbbi felszabadulásához és a csatlakozások kialakulásához vezet. Ez az új ismeret segíthet új maláriaellenes beavatkozások azonosításában.
Eredmények
A PfRH1-specifikus mAb-k gátolják a merozoin invázióját
Ebben a munkában a PfRH1 segítségével tanulmányozzuk a fő eritrocita invázióhoz vezető intracelluláris jelátviteli eseményeket. Korábban kimutattuk, hogy a PfRH1 vörösvértest-kötő régióját (RII-3) célzó antitestek (1a. Ábra) gátolhatják a merozoin invázióját 7. Itt négy monoklonális antitestet (Acb: C49, C41, C2 és C50) állítottunk elő e régió ellen, és Western blot és immunfluoreszcencia vizsgálatokkal validáltuk azok specifitását. Minden antitest felismeri a várható 240 és 140 kDa kezelt PfRH1 formát a T994 parazita tenyészet felülúszójának, merozoitáinak és skizontjainak kivonataiban, míg a PfRH1 T994ARHH1 inaktivációs vonalában nem észleltünk ekvivalens sávot (S1a - c. Kiegészítő ábra). Az immunfluoreszcenciás tesztek azt mutatták, hogy az összes mAb részben lokalizált pontmotívumokat adott EBA175-gyel (ismert mikronémfehérje) a merozoiták apikális végén a T994-ben, ami megfelel a PfRH1 előre jelzett helyének (S1d. Ábra). Nem figyeltünk meg festést a T994ΔRH1-ben (S1e. Kiegészítő ábra), ami megerősíti az mAb-k specifitását.
( nál nél ) Teljes hosszúságú PfRH1, beleértve a szignálszekvenciát (SS, piros), az RII-3 eritrocita-kötő régiót (kék, 500-833 aminosavakat magában foglaló) és a transzmembrán domént (TM, sárga). ( , vs. ) Inváziós gátlási vizsgálatok anti-PfRH1 (IgG) mAb-k alkalmazásával a T994-ben ( ) és T994ΔRH1 ( vs. ). Az oszlopdiagramok mutatják az átlag ± hét; n = 3. * P ≤0.0003 egyirányú ANOVA-val, jelezve, hogy a C49 sikeresen blokkolta a T994 invázióját a C2 és C50 jelenlétében történt invázióhoz képest. + P ≤ 0, 0003 egyirányú ANOVA-val, jelezve, hogy a C41 szignifikánsan gátolta az inváziót a C2-hez és a C50-hez képest.
Teljes méretű kép
A gátló mAb-k blokkolják az inváziót a csomópont kialakulása előtt
Teljes méretű kép
A PfRH1 gátló mAb-k blokkolják a Ca 2+ jelátvitelt invázió során
Teljes méretű kép
A merozoiták életképessége
Teljes méretű kép
Az EBA175 inhibitor mAb nincs hatással a Ca 2 jelátvitelre+
A publikált adatokkal összhangban eredményeink azt mutatják, hogy a PfRH1-nek közvetlen szerepe van a Ca 2+ felszabadulásában, amely ezt követően kiváltja a mikronéma és az EBA175 szekrécióját. Ha ez valóban helyes, akkor arra lehet számítani, hogy az EBA175 funkció blokkolása és így a csomópontok kialakulása nincs hatással a Ca 2+ jelzésre. Ennek további vizsgálatához az inváziót blokkoló R215 mAb-t használtuk, amely az EBA175 II régiót célozza meg (30. hivatkozás). Amint azt korábban leírtuk, az R215 mAb képes blokkolni az inváziót a dózistól függően, maximális gátlása körülbelül 47,7% ± 1,11 0,25 mg ml -1 mellett (5a. Ábra) 30. Ennek az antitestnek azonban nincs hatása az intracelluláris Ca 2+ jelátvitelre invázió során (5b. Ábra, 1-6. Kiegészítő adat). Ez az eredmény megerősíti, hogy az EBA175-et megcélzó anti-inváziós antitestek a Ca 2+ szignalizációt követően, míg a PfRH1-t célzó antitestek a Ca 2+ szignalizáció előtt hatnak, és egyértelműen kiemelik a PfRH1 és az EBA175 különböző szerepeit.
( nál nél ) Inváziógátlási vizsgálat anti-EBA175 mAb R215 alkalmazásával T994 parazitákban. Az oszlopdiagramok az EBA175-specifikus R215 mAb különböző koncentrációinak (0,25-0,008 mg ml -1) inváziójának gátlását mutatják be a T994-ben. Az oszlopdiagramok mutatják az átlag ± hét; n = 3. ( ) A citoszolos Ca 2+ szinteket fluoreszcens lemezolvasóval detektáltuk. A Fluo-4AM-mal előretöltött T994 merozoitákat inkubáltuk vörösvértestekkel (RBC) vagy R215 jelenlétében (RBC + R215 (0,2 mg ml -1)). Pozitív kontrollként az A23187 Ca2+ ionofort (RBC + A23187) használtuk. A citozolos Ca 2+ szint változásait a merozoin invázió során idővel értékeltük fluoreszcencia lemezolvasóval. A merozoiták citoszolos Ca 2+ szintjének teljes változását tükröző ≤ΔF (t) értékét az idő függvényében ábrázoltuk. A kísérleti adatokat átlag ± wk-ként adtuk meg; n = 3.
Teljes méretű kép
A PfRH1 inhibitor mAb blokkolja az EBA175 expresszióját
Teljes méretű kép
A $ config [ads_text16] nem található
Vita
A jövőben fontos lesz tovább meghatározni azt a mechanizmust, amellyel az RH által közvetített jel a merozoitához kerül, hogy kiváltsa a Ca 2+ felszabadulást. Eredményeink összességében új betekintést nyújtanak a finoman szabályozott jelátviteli kaszkádba, amely szükséges a merozoit sikeres inváziójának biztosításához, és utat nyit az apikális organellumok szabályozott szekréciójában részt vevő jelátviteli utak elemzéséhez az invázió során. Ez együtt jobban megismeri a merozoin invázióban fontos jelátviteli mechanizmusokat és azt, hogy ezek a folyamatok miként jelenthetik a malária-intervenció új célpontját.