A szülészeti klinikáról
1 A Charité Universitätsmedizin Berlin Orvostudományi Karának Szülészeti Klinikájáról ÉRTEKEZÉS Th.1 -cytokinek és protrombináz fgl2 normál és kóros terhességben Beküldve a Humboldt Egyetem Charité Orvostudományi Karára a Doctor Medicinae tudományos fokozat megszerzéséhez (Dr. med.) Maike Knackstedt, Berlin, Berlin
2 dékán: Prof. Dr. med. J.-W. Dudenhausen Prof. Dr. med. Matin Paul lektor: 1. Prof. Dr. med. J.-W. Dudenhausen 2. Prof. Dr. med. habil. H. Donat 3. Prof. Dr. med. G. Schönfelder Doktori fokozat: 2004. szeptember 24
3 Tartalomjegyzék 3 Tartalomjegyzék Rövidítések listája 5 Célkitűzések 6 1 Bevezetés Az embrió beültetésének alapjai A terhesség kezdete A transzplantációs modell Kóros beültetés A terhesség immunológiai alapjai A Th 1/Th 2 paradigma A Th 1 citokinek szerepe a terhességben Az immunológiai egyensúlyhiány következményei terhességben A koagulációs rendszer aktiválása Az apoptózis szerepe a terhességben A spontán abortusz szempontjai A spontán abortusz immunológiai elvei Két abortuszmodell CBA/J egerekben: stressz versus IL preeklampszia immunológiai aspektusai 21. kérdés 2 Anyag és módszer Kísérleti állatok Betegcsoportok Állatkísérletek kísérleti beállítása Abortusz arány százalékban Szövetkészítés Teljes RNS-extrakció Az RNS-minták DNS-kezelése Reverz transzkripció Kvalitatív PCR Agarose elektroforézis Taq-Man adatok kvantitatív PCR-analízise Plasmid DNS előállítása a 35 S-jelölt RNS szonda plazmid cDNS-szintézisének kis léptékű (mini előkészítése) linearizálása in situ hibridizációval immunhisztokémia TUNEL festés Giemsa festés az adatok statisztikai elemzése 41
4 Tartalom 4 3 Eredmények Az abortusz arányának növekedése a stressz és az IL-12 injektálása révén p A stressz hatása az abortogén citokinek mrna expressziójára A TNF-α mrna növekedése a stressz hatására Az IFN-y expresszió a stressz alkalmazása után meghal Az IL-12 mrna expressziójának hatása stresszel Az abortusz arányának és a citokinek mennyiségi arányának aránya A citokin profil az IL injekciója után Az fgl2 mrna expressziójának összehasonlítása stressz alatt és az IL injekciója után Apoptózis indukálása stresszel és IL-vel -12 egérmodellben A TNF-α expressziója az első trimeszterben és a harmadik trimeszterben Az fgl2 mrna és az fgl2 fehérje expressziója az emberi placenta szövetében Az első trimeszter A harmadik trimeszter Apoptózis preeclampsiaban és spontán abortuszban 59 4 Beszélgetés 61 5 Összefoglalás 72 6 Publikációs lista 74 7 Függelék 91.
5 Rövidítések listája 5 Rövidítések listája// Növekedés/Csökkentés/állandó ASA-acetilszalicilsav CD Differenciálódási csoport DNS Dezoxiribonukleinsav (A = Sav) COX Ciklooxigenáz EGF Epidermális növekedési faktor fgl2 Fibrinogén-szerű-Protein 2 HLA Humán-Leukochin-antigén-Leukochin-antigén Transferáz IDO Indolamin-2,3-Dioxigenase IFN-γ Interferon-gamma IL Interleukin IRF Interferon-Regulatory-Factor LIF Leucemia-Inhibitor-Factor LPS Lipopolysacharide MHC Major-Histocompatibility-Complex MHV3 egér Hepatitis-Virus MIP Macrophage-Inflam mrna (messenger) ribonukleinsav (A = sav) NK sejtek/uNK sejtek Természetes gyilkos sejtek/méh NK sejtek NO nitrogén-oxidok NOS (inos) nitrogén-oxid szintáz (indukálható nitrogén-oxid szintáz) OX orexin = CD 200 PAI plazminogén aktivátor gátló PCR polimeráz láncreakció PE preeclampsia PMNL polimorfonukleáris leukociták RT reverz transzkriptáz TGF transzformáló növekedési faktor Th T segítő sejt TNF-α tumor nekrózis faktor-alfa VEGF vaszkuláris endoteliális növekedési faktor
6 6. célkitűzés Célkitűzés A dolgozat célja, hogy egér modellben 1-re, a CBA/J-nőstények és a DBA/2J-hímek kombinációjával mutasson különbségeket a méh citokin profiljában és a protrombináz fibrinogén-protein 2 (rövid fgl2) stressz okozta szerepében. és gyulladás okozta abortusz. A 2. ábra a citokin profil jellemzésére a koagulációs rendszer esetleges aktiválódása kapcsán az fgl2, mint protrombináz révén, normál terhességű betegek és az első trimeszterben abortuszt szenvedő betegek decidualis szövetében. A 3. ábra a Th 1 citokinek és az fgl2 expressziójának leírása a placenta szövetében, komplikáció nélküli terhességi és preeclampsia-betegeknél.
22 Bevezetés 22 Terhességi szövődmények Spontán abortuszt és preeclampsia-t, valamint az immunológiai egyensúlyhiányhoz való kapcsolódást vizsgálják.
25 Anyag és módszerek 25 Beültetési reszorpció 3. ábra: A V alakú egér méh egyik oldalszarvának ábrázolása Az egér méhében két beültetés () és két reszorpció () látható a terhesség 13.5. Napján, ezért a méh fentebb látható laterális szarvában fekszik az abortusz aránya 50%. 2.5 A szövetek előállítása A molekuláris biológiai vizsgálatokhoz 100 mg méhszövetet készítettünk a sikeres beültetés helyeiről, majd steril PBS-sel (pH = 7,4) gondosan mossuk, majd folyékony nitrogén segítségével azonnal lefagyasztjuk, és 80 ° C-on tároljuk, amíg az RNS-t el nem izoláljuk. A reszorpciós oldalról nem vettünk szövetmintát, mivel a szövet már vérzéses módon lebomlott, nekrotikus és próbatesztek azt mutatták, hogy ez a szövet alkalmatlan a citokin diagnosztikához. 2.6 Teljes RNS-extrakciós anyag: Trizol kloroform-etanol (100%, 75%) agaróz-gél 1,5% etidiuim-bromid (10 mg/ml) Despergierstation Centrifuga (5415C) Gibco BRL, Karlsruhe, D Merck, Darmstadt, D Merck, Darmstadt, D Biozym, Oldendorf, D Gibco BRL, Karlsruhe, DT 8.10, IKA Labortechnik Eppendorf, Hamburg, D
31 Anyag és módszerek (hipoxantin-foszforibozil-transzferáz), amelyet referenciagénként kapunk. A próbákat mind ellenőriztük a cdna specifitására, vagyis a genomi DNS-t nem amplifikáltuk. Primer szekvenciák: rágcsálók HPRT: Ex 7.8: 5 -gttggatacaggccagactttgt Reverse: 5 -CACAggACTAgAACACCTgC rágcsálók IFN-y: Előre: 5 -CagCAACAACATAAgCgTCAT Fordított: 5 -CTCCTTTTCCgCTTCCGgg Murines fgl2: Forward: 5 -CAACAgTTTggATggCAAgTg Reverse: 5 -CTTTgTATATTAgATgAACCgg Murines IL-12 p40: Forward: 5 -TTCAgTgTCCTgCCAggAgg Backward: 5 -CgggTCTCCGGTTTGATgATg HPRT: 5-6FAM-TTgCAgATTCAACTTgCgCTCA XT CTT p PCR hőmérséklet: 60 C vagy 63 C rágcsálófélék IFN-γ: 5-6FAM-TTCCggCAACAgCTggTggACCAC XT p PCR hőmérséklet: 60 C rágcsálók TNF-α: 5-6FAM-gTAgACAAggT PCR-hőmérséklet: 63 C Rágcsálófélék fgl2: 5-6FAM-gTgTCCCAgCCAAgAACACA XT gca p PCR-hőmérséklet: 63 C
41 Anyag és módszerek Az adatok statisztikai elemzése Az immunhisztokémia szemikvantitatív értékeléséhez rendes skálát használtunk +/++/+++ besorolással. Ezen adatok statisztikai elemzéséhez a Mann-Whitney U tesztet alkalmaztuk nem-paraméteres tesztként független mintákhoz. Az adatok grafikusan, dobozos ábrákon jelennek meg. A valós idejű PCR-t a fent leírtak szerint értékeltük. A normál eloszlás megközelítő tesztje után az adatokat a Student s T-próbával értékeltük és oszlopdiagramokban adtuk meg, szórással.
47 Eredmények 47 Hasonlóképpen, az IL-12 p40 (r = 0,24) és az IL-12 p35 (r = -0,29) sem mutat összefüggést a reszorpciók arányával (11. és 12. ábra) az abortuszok% -ával r = IL-12 p40mrna 11. ábra: Korreláció az abortuszok százaléka és az IL-12 expresszált p40 mrna mennyisége között Nincs összefüggés az IL-12 p40 mennyisége és a reszorpciók százalékos aránya között az abortuszok% -a r = IL-12 p35 mrna 12. ábra: Az abortusz arányának százalékos aránya és az expresszált IL-12 p35 mrna mennyisége közötti kapcsolat Nincs összefüggés az IL-12 p35 mennyisége és a reszorpciók százalékos aránya között.
48 Eredmények A citokin profil az IL-12 injekciója után A kérdés az, hogy az IL-12, mint T-sejt aktív citokin, képes-e indukálni a Th 1 immunválaszt az egérben, ami ezután az abortusz arányának növekedéséhez vezet. Az IL-12 injektálása után a mérések 9,5-szeres növekedést mutattak az IFN-y mrna-ban (13. ábra). Érdekes módon az injektált, rekombináns IL-12 hatással volt a TNF-a expressziójára is: Az injekció után a TNF-a mrna expressziója 8,8-szorosára nőtt (13. ábra). Az IL-12 által végzett stimuláció után következésképpen összehasonlítható citokin konstelláció következett be, nagy mennyiségű TNF-α és IFN-γ egyidejű jelenlétével, mint mindkét citokin egyidejű injektálásakor: mrna 10 = 8-szorosa n = 5 n = 7 n = 7 kontroll, nincs injekció IFN-γ mrna IL-12 injekció után TNF-α mrna IL-12 injekció után 13. ábra: Citokin-szabályozás az IL-12 p70 injektálása után A TNF-α és IFN-γ szignifikáns növekedése a Rekombináns IL-12 injekciója p Az fgl2 mrna expressziójának összehasonlítása a stressz alatt és az IL-12 injektálása után Az in situ hibridizáció szövettanilag mutatja az fgl2 mrna lokalizációját a CBA/J egerek méhében a 13.5. Terhesség (14. ábra).
50 Eredmények 50 Megállapítottuk azonban, hogy a TNF-α mrna mennyisége negatív kapcsolatban áll az fgl2 mrna mennyiségével (16. ábra). Nem volt statisztikailag egyértelmű kapcsolat az fgl2 mrna és az IFN-y mrna között (17. ábra). 9,5 9,0 TNF-α mrna 8,5 8,0 7,5 7,0 r = Fgl2 mrna 6 8 16. ábra: A TNF-α mennyisége és az fgl2 mrna mennyisége közötti kapcsolat Nem mutat szignifikáns hatást A TNF-α és az fgl2 mrna mennyisége közötti összefüggés, a két paraméter közötti negatív kapcsolat tendenciának tekinthető. 14 IFN- γ mrna r = 0, Fgl2 mrna 6 8 17. ábra: Kapcsolat az IFN-γ mrna mennyisége és az fgl2 mrna expresszált mennyisége között Nincs összefüggés az IFN-γ mennyisége és az fgl2 mrna mennyisége között.
53 Eredmények 53 A B 20. ábra: A TNF-α immunhisztokémiája normális terhesség esetén a 3. trimeszter placentájában (A) mutatja az IgG kontrollt és (B) a TNF-α fehérje festését. A B Trophoblast edény 21. ábra: A TNF-α immunhisztokémiája a preeclampsia betegek 3. trimeszterében méhlepényében (A) mutatja az IgG kontrollt és (B) a TNF-α fehérje festését. A preeclampsia TNF-α fehérje-pozitív sejtjeinek specifikus elemzését az 1. táblázat mutatja: Szöveti eredetű endothelium Trophoblast Placentális makrofágok PE (n = 10) +/++ + +/++ Kontroll (n = 12) + +/- +/++ 1. táblázat: A TNF-α immunohisztokémiája a 3. trimeszter placentájában normál terhességben és preeclampsia-betegeknél A TNF-α fehérje expressziójának növekedése endothelsejtekben és trofoblasztokban preeclampsia (PE) a normál terhességhez képest. Nincs különbség a TNF-a fehérje expressziójában a trofoblaszt sejtekben és a placenta makrofágokban.
54 Eredmények Az fgl2 mrna és az fgl2 fehérje expressziója emberi placenta szövetben Az első trimeszter a 22. ábra az in situ hibridizációval kapott adatokat mutatja. A B 22. ábra: In situ hibridizáció az fgl2 mrna esetében az 1. trimeszterben lévő villus (A) az érzékszervi kontrollt és (B) az fgl2 mrna antiszensz festését mutatja. Az első trimeszterre jellemző, a syncytiotrophoblastokból és a citotrophoblastokból álló kétsejtű trofoblaszt rétegű placentás villusokat mutatjuk be. Az in situ hibridizációt 35 S-jelölt fgl2 mrna próbával végeztük. Mindkét bemutatott villiban a trofoblaszt réteg tipikus fekete jelölése van az antiszensz mintában, az mrna minta az fgl2 mrna szekvencia tükörképe. A negatív kontrollban, az érzékmintában, amelyben a minta azonos az fgl2-mrna szekvenciával, nincs pozitív jel. A trofoblaszt pozitív jeleket mutat (barna) az fgl2 fehérje iránt az immunhisztokémiában (21. ábra).
55 Eredmények 55 A B 23. ábra: Az fgl2 immunhisztokémiája az 1. trimeszter placentájában normál terhesség esetén (A) az IgG kontrollt mutatja, és (B) az fgl2 fehérje festését és az ér reprezentatív szakaszát mutatja. Ezek az eredmények először mutatják, hogy az fgl2 mrna és az fgl2 fehérje expresszálódik az emberi trofoblaszt sejtekben, különösen, ha spontán abortusz történt. Az fgl2-pozitív erek száma az erek teljes számában nőtt, ha spontán abortusz történt (24. ábra). Fgl2 pozitív erek/erek teljes száma 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 n = 6 * n =% medián 25% kontroll spontán abortusz 24. ábra: fgl2 fehérje expresszió az endothel sejtekben Hajók az első trimeszterben Az fgl2 immunhisztokémiájának félkvantitatív elemzése a kontroll és a spontán abortusz decidua basalis edényein.
56 Eredmények 56 A zottikus trofoblasztok fgl2 expressziójának szemikvantitatív értékelése azt mutatja, hogy az abortuszt szenvedő betegeknél magasabb a fgl2 expresszió, mint a terhesség elektív módon megszakított betegeknél (25. ábra). Az fgl2 pozitív zottikus trofoblasztok festési intenzitása 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,5 0,5 0,5 n = 6 * n = 9 75% medián 25% kontroll spontán abortusz 25. ábra: fgl2 fehérje expresszió trofoblasztokban az első trimeszterben Az fgl2 immunhisztokémiájának félkvantitatív elemzése a decidua basalis trofoblaszt sejtjein a kontroll és a spontán abortusz AB edény trofoblasztjaiban 26. ábra: Az fgl2 immunhisztokémiája az abortuszt szenvedő betegek 1. trimeszterében méhlepényben (A) mutatja az IgG kontrollt és (B) mutatja az fgl2 fehérje festését és az ér reprezentatív szakaszát.
58 Eredmények 58 A következő 28. ábra a harmadik trimeszterben érett placenta villit mutat be normális terhességi lefolyással. A trofoblaszt sejtek időnként expresszálják az fgl2 fehérjét (26. B ábra). A 29. ábra egy preeclampsia-beteg méhlepényét mutatja be, a trofoblasztok homogénebben expresszálják az fgl2 fehérjét. A B erek 28. ábra: Az fgl2 immunhisztokémiája normális terhesség mellett a 3. trimeszter méhlepényében (A) az IgG kontrollt és (B) az fgl2 fehérje festését mutatja. A B 29. ábra: Az fgl2 immunhisztokémiája a preeclampsia betegek 3. trimeszterében méhlepényében (A) az IgG kontrollt és (B) az fgl2 fehérje festését mutatja. Ennek a megfigyelésnek megfelelően lenyűgöző fibrin-lerakódások voltak megfigyelhetők a preeclampsia-betegek placentamintáiban a komplikáció nélküli terhesség placenta-mintáihoz képest.
59 Eredmények Apoptózis preeclampsia-ban és spontán abortusz A Th 1 citokinek, különösen a TNF-α, képesek programozott sejthalált kiváltani apoptózis formájában. Az apoptotikus jelek vizsgálata az első trimeszterben és a harmadik trimeszterben azt mutatta, hogy az apoptózis szignifikánsan nagyobb előfordulását figyelték meg mind a decidua, mind a preeclampsia placentában (30. ábra). A TUNEL + sejtek látómezőnként 2,5 * 2,0 1,5 n = 5 1,0 0,5 5 n = 6 B TUNEL + sejtek látómezőnként * n = n =% medián 25% 4 kontroll spontán abortusz kontroll preeclampsia ábra 30. ábra: Apoptózis az első és a harmadik trimeszterben A: Az apoptotikus jelek félkvantitatív elemzése spontán abortusz során. B: Az apoptotikus jelek félkvantitatív elemzése preeclampsia esetén.
60 Eredmények 60 A 31. ábra az apoptózist mutatja a placentában a harmadik trimeszterben. 31. ábra: Apoptózis a harmadik trimeszterben A sejtmagok kék színűek, az apoptotikus fragmensek zölden fluoreszkálnak.