A terápiás exon kihagyása a diszferlinopátiák miatt európai genetikai folyóirat

  • Témák
  • Absztrakt
  • bevezetés
  • A módszerek
  • Adatbázis
  • AON
  • Sejtkultúra és transzfekció
  • RNS elemzés
  • Eredmények és vita
  • Exon ugrás a diszferlinért
  • A DYSF exonok rangsorolása
  • A DYSF exon kihagyásának megvalósíthatósága
  • Záró megjegyzések

Témák

  • Alternatív illesztés
  • Antiszensz elemek
  • Neuromuszkuláris betegség
  • A cikk helyesbítését 2010. augusztus 19-én tették közzé

Absztrakt

bevezetés

A végtagi öv 2B típusú izomdisztrófiája (LGMD2B), Myoshi myopathia (MM) és disztális myopathia az elülső tibialis kezdettel (DMAT) az autoszomális recesszív allélizom betegségei, amelyeket a diszferlint kódoló DYSF gén mutációi okoznak, ami súlyos vagy teljes hiányhoz vezet. a fehérje diszferlin. 1, 2, 3 A legtöbb páciensnek kicsi a mutációja: A frame stop vagy frame shift mutációk idő előtt csonka fehérjékhez vezetnek, míg a missense mutációk általában befolyásolják a fehérje stabilitását. 4 Több mint 100 különféle mutációról számoltak be a Leiden Open Variation Database csaknem 200 betegen (www.dmd.nl). Mivel jelenleg a "diszferlinopátiák" kezelésére nincs lehetőség, a diszferlin hiánya a végtag és az öv izmainak fokozatos szövet- és funkcióvesztését eredményezi. 5.

exon

A diszferlin fehérje sok szövetben expresszálódik, de elsősorban a szívben és a vázizmokban. Ez utóbbi esetben a fehérje a plazmamembrán szintjén és a citoplazmatikus vezikulákban helyezkedik el. 6 Úgy gondolják, hogy a diszferlin szerepet játszik a vezikuláris kereskedelemben és a membránfoltok fúziójának helyreállításában az izomsejtekben. 5 A diszferlin elvesztése veszélyezteti a vázizom membránjának helyreállítását, és az izomrostok progresszív elvesztéséhez vezet. 6 A fehérje különböző doménekkel rendelkezik (1. ábra). Az ENSEMBL adatbázis hat vagy hét kalciumfüggő C2 lipidkötő domént, egy transzmembrán domént, valamint több "vas" és "diszfunkció" domént jósol. A C2 domének valószínűleg kalciumfüggő vezikulák fúzióját közvetítik a plazmamembránnal, míg a transzmembrán domének horgonyozzák a fehérjét a plazmamembránhoz. 5 A vas és a diszfunkció domének még mindig ismeretlen funkcióval rendelkeznek. 4

Dysferlin domének és DYSF exonok. A Dysferlin hat vagy hét kalciumfüggő C2 lipidkötő domént (C2), transzmembrán domént (T), ferl domént (L), FerA és FerB domént (rendre A és B), valamint Dysf_N és Dysf_C domént (N és D C, ill. A C2 és a transzmembrán domének feladata a membrán helyreállítása. A többi tartomány funkciója még mindig ismeretlen.

Teljes méretű kép

Így lehetséges, hogy a diszferlin mutációk megkerülése több (részben) funkcionális diszferlin fehérjéhez vezet, és ezért terápiás potenciállal bír. Ennek egyik módja a diszferlin pre-RNS-ek splicingjének modulálása antiszensz oligonukleotidok (AON) vagy antiszensz szekvenciák alkalmazásával, amelyek elfedik a splicing gép célexonjait, így azok nem szerepelnek a végső mRNS-ben („exon átugrása”). ) (2. ábra). A koncepció kezdeti bizonyítékát a közelmúltban mutatták be a kontroll és a páciens eredetű sejtekben, ahol a 32 exon kihagyását AON-ok vagy módosított U7 snRNP indukálta, amelyben az eredeti antiszensz szekvenciát a cél antiszensz szekvenciával helyettesítették. 9.

Az antiszensz által indukált exon kihagyása. Bal oldali panel: ebben a példában a 32 exon mutációja idő előtti stop kodont eredményez (amelyet az pre-mRNS (felső) és az mRNS (középen) feketéről fehérre váltása mutat, ami idő előtt csonka fehérjéhez vezet (alsó) Jobb panel: Ha a 32 exont megcélzó antiszensz oligonukleotidokat (AON) használnak, ezek az exonnal hibridizálódnak, így elfedik a splicing mechanizmustól, ami miatt ez az exon átugrik. A keretben lévő 32 exon (hossza osztható három), az átugrás nem zavarja az olvasási keretet (az mRNS fekete lesz a középső panelen), és egy teljes fehérje keletkezhet, amely közepén kicsit hiányzik (alul).

Teljes méretű kép

Valójában az exon-átugrási módszer a legígéretesebb terápiás megközelítés a Duchenne-féle izomdisztrófia (DMD) esetében. Ezt a betegséget a funkcionális dystrophin teljes elvesztése okozza olyan mutációk miatt, amelyek megzavarják a DMD gén nyitott olvasási kereteit. A diszferlinhez hasonlóan a dystrophin is tartalmaz esszenciális és kevésbé esszenciális doméneket, ezt hangsúlyozza az a tény, hogy a központi redundáns domén alatt mutációval rendelkező betegek kevésbé súlyos állapotban vannak, az úgynevezett Becker izomdisztrófiája. 12., 13., 14. A gyógyszeres exon átugrása az AON-t DMD-ben szenvedő betegek célja a nyitott olvasási keret helyreállítása, részben funkcionális fehérje termelésének lehetővé tétele és a súlyos DMD enyhébb BMD-fenotípussá történő átalakítása. Ezt a megközelítést laboratóriumunkban és Japánban, Ausztráliában és az Egyesült Királyságban dolgozó kollégák fejlesztették ki 10, 15, 16, 17, 18, és jelenleg az I/II fázisú klinikai vizsgálatokban vesz részt. 19, 20

Ebben a tanulmányban elemezni fogjuk, hogy mely DYSF exonok lehetnek alkalmas célpontok az antiszensz-közvetített exonugráshoz, és melyek kevésbé vagy alkalmatlanok, a fehérjét kódoló doménektől és a jelentett mutációktól függően. Megmutatjuk azt is, hogy az AON DMD készletünk retrospektív elemzése után megfogalmazott ajánlásaink felhasználása lehetővé teszi a DYSF exon kihagyását kiváltó AON könnyű azonosítását .

A módszerek

Adatbázis

A DYSF LOVD adatbázisban (www.dmd.nl) 2009. május 8-án jelentett mutációkat elemeztük.

Az AON megtervezése a DMD exonokra vonatkozó ajánlásainkon alapult, és célul tűzte ki a részben nyitott másodlagos RNS struktúrák megcélzását (m-21-es előrejelzéssel), a megjósolt RESCUE-ESE és SC35 jelenlétét, valamint a megjósolt Tra2 β-helyek hiányát (a emberi splicing). kereső 22) és kedvező kötési energiát. 21, 23 Az összes AON (1. táblázat) a belső exonszekvenciákat célozza meg, és teljes hosszúságú foszforotioát gerincvel rendelkező 2′-O-metil RNS-ből áll, és az Eurogentec (Seraing, Belgium) gyártotta.