Az egér bélgyulladásának kiváltása az Effector CD4 CD45RBhigh T sejtek adaptív átvitelével

Absztrakt

Az emberi gyulladásos bélbetegség (IBD) patogenezisének tanulmányozásához sokféle állatmodell létezik, mindegyiknek megvannak a maga előnyei és hátrányai. Itt leírunk egy kísérleti vastagbélgyulladás-modellt, amelyet a szingenikus lép CD4 + CD45RB magas T-sejtek adoptív transzferje indít el a T- és B-sejt-hiányos egerek befogadóiban. A nagyrészt naiv effektorsejtekből álló CD4 + CD45RB magas T-sejtpopuláció krónikus bélgyulladást indukálhat, nagyon hasonlóan az emberi IBD fontos aspektusaihoz. Ez az eljárás manipulálható a betegség kialakulásának és progressziójának szempontjainak vizsgálatához. Ezenkívül felhasználható a veleszületett, adaptív és szabályozó immunsejtpopulációk funkciójának, valamint a környezeti tényezők, vagyis a mikroflóra szerepének tanulmányozására a bélgyulladásban. Ebben a cikkben elmagyarázzuk a vastagbélgyulladás kiváltásának módszerét lépésről-lépésre. Ez magában foglalja a legfontosabb technikai szempontok bemutatását, amelyek szükségesek a kísérleti vastagbélgyulladás ezen egérmodelljének kutatási célú sikeres fejlesztéséhez.

Jegyzőkönyv

MEGJEGYZÉS: Győződjön meg arról, hogy minden állati protokollt jóváhagyott az Intézményi Állattenyésztési és Felhasználási Bizottság (IACUC) rendeletei és az Országos Kutatási Tanács laboratóriumi állatok gondozására és felhasználására vonatkozó kézikönyve, és összhangban van velük. A donor egerek lehetnek hímek vagy nőstények, de a befogadó egerek hímek. Ha nőstény recipienseket kell használni, akkor a donor egereknek nősténynek kell lenniük. Rendszeresen tartsa fenn a kolóniákat nem steril ágyak és nem savas víz használatával, mivel ezek hatással vannak a bélflóra és így az egerek vastagbélgyulladás-fenotípusára 5,6.

  1. Használjon jéghideg közeget és puffereket. A kísérlet során tartsa a sejteket jégen.
  2. Hajtsa végre a kísérletet steril, biológiai veszélyekkel járó csuklyában, steril technológiával.

2. A lép T-sejtjeinek izolálása

3. CD4 + T-sejtek dúsítása

Megjegyzés: Kövesse a gyártó utasításait az ebben a szakaszban használt egyes termékekre vonatkozóan.

4. A cellák címkézése és rendezése 7

sejtek
1. ábra: A CD4 + CD45RB T-sejtpopulációk reprezentatív áramlási citometriás ábrái a FACS-elemzés során (A. - C) A donor C57BL/6 egerekből származó FITC CD4- és PE ​​CD45RB-vel festett splenocitákat FACS-mal rendeztük CD4 + CD45RB high és CD4 +. CD45RB alacsony T-sejt populációk. (A) Kettős események kizárva az első szórási ábrán. (B) A limfocitákat előre- és oldalsó szórási grafikonon kaptuk. (C) CD4 + T-sejteket kapuztattunk, és (D) A CD4 + CD45RB + T sejteket egy PE versus esemény hisztogramon ábrázoltuk. A CD4 + CD45RB alacsony sejteket tekintettük a CD45RB + sejtek legalacsonyabb 20% -ának. Meghatároztuk, hogy a CD4 + CD45RB magas sejtek a legmagasabb 40% -os CD45RB + sejtek.

  1. Futtasson egy-egy alikvot részt az egyes sejtpopulációkból az FACS-gépen a populáció tisztaságának felmérése céljából.
  2. Centrifugáljuk a sejteket 450 g-on 7 percig, 1 ml PBS-ben szuszpendálva. Távolítsa el a sejtek alikvot részeit a sejtek életképességének megszámlálásához és értékeléséhez tripánkék kizárással a 2.9. Lépés szerint.

5. A sejtek injekciója a befogadókba

  1. A szétválogatott sejteket reszuszpendáljuk 4 x 106 sejt/ml (magas CD45RB) vagy 2 x 106 sejt/ml (alacsony CD45RB) értékre PBS-ben.
  2. Helyezzen 100 μl CD45RB magas sejtet recipiensenként új steril csövekbe. Adjon 100 μl PBS-t címzettenként ebbe a csőbe. Az állatonként beadott összes mennyiség 200 μl, a befogadónkénti sejtek összmennyisége 4 × 105 CD4 + CD45RB erősen naiv T-sejt.
  3. Ha szabályozó T-sejteket tartalmazó kísérleti csoportra van szükség, akkor új steril csövekbe adjon 100 μl CD45RB sejtet recipiensenként. 100 μl alacsony CD45RB-sejt sejtenként, ugyanazon a csövön. Az állatonkénti összes injekció mennyisége 200 µl; A magas CD45RB: alacsony CD45RB sejtek aránya 2: 1.
  4. Injektáljon 100 μl CD45RB magas vagy CD45RB magas/alacsony CD45RB CD4 + sejteket intraperitoneálisan az egyes betegek hasának jobb és bal oldalába (összesen 200 μl).

6. A betegség progressziójának ellenőrzése a befogadó állatoknál

  1. A befogadó állatok klinikai állapotának felmérése érdekében a következő paraméterek összesített klinikai pontszáma az injekció beadásának napján 8, ezt követően hetente és leöléskor:
    1. Határozza meg a veszteséget a fogyás mérésével: 0 - nincs fogyás; 1 - 0,1-10% az eredeti testtömeg csökkenés; 2 - az eredeti testtömeg több mint 10% -os csökkenése (2A. Ábra).

effector
2. ábra: A vad típusú CD4 + CD45RB magas T-sejtek transzferje után bekövetkező gyulladás klinikai és kóros jelei jelentkeznek a Rag1 -/- és az NRDKO recipiens egerekben 11 (A) Az NRDKO-os betegek átlagosan 10% -ot vesztettek eredeti testsúlyukból 5. Az átvitel után hetekkel, míg a Rag1/recipiensek abban az időben nem mutatják a betegség klinikai tüneteit. Minden pont a kohorsz kezdeti testtömegének átlagos százalékát jelöli ± SEM. ** A P -/- és az NRDKO befogadó egerek megvastagodnak és rövidülnek a Rag1 -/- és NRDKO egerekből származó vastagbélekhez képest, T-sejtek befogadása nélkül. Az NRDKO recipiens egerek vastagbélei súlyos gyulladást és fokozott elhízást mutatnak (az adatokat nem közöljük). A kép nagyobb verziójának megtekintéséhez kattintson ide.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Reprezentatív eredmények

Körülbelül 10 x 106 CD4 + CD45RB magas T-sejtet felnőtt C57BL/6 donor egerek 10 lépéből megbízhatóan izolálunk. Ez a szám a donor egér korától és törzsétől, valamint a kutató képességeitől függ. Amikor 4 x 105 C57BL/6 CD4 + CD45RB magas T-sejtet viszünk át a C57BL/6 Rag1 -/- recipiens egerekbe, a betegség klinikai tünetei a telítés után körülbelül 5 héttel, vagy hamarabb jelentkeznek, ha az egerek genetikailag hajlamosabbak a súlyosabb betegségre ( 2., 3. ábra) 11.12. A CD3 + T-sejtek a Rag1 -/- recipiens vastagbélében már 3 héten belül láthatók (3A) 12.

effector
3. ábra: A vad típusú CD4 terjedése + A CD45RB magas T-sejtjei a Rag1 -/- és az RKO/δ KD recipiensekben krónikus bélgyulladást indukálnak 12 (A) (Eredeti nagyítás 10X, H&E és CD3 Immunhisztokémia). A H&E festés (felső panelek) epitheliális hiperpláziát, infiltrált gyulladásos sejteket és kriptatályogokat (nyíl) mutat az RKO/δ KD recipiensben, de a Rag1 -/- recipiensben nem. Az RKO/δ KD recipiens egerekből származó vastagbélek szignifikánsan felhalmozták a CD3 + T sejteket a CD3 IHC-vel (alsó lemezek), összehasonlítva a Rag1 -/- recipiensek vastagbeleivel. (B) Az RKO/δ KD recipiens egerekből származó vastagbélek súlyosabb gyulladást mutattak a Rag1 -/- recipiens egerekből származó vastagbélekhez képest, hisztológiai pontozással meghatározva. (C, D) RKO/8 KD befogadó egerekből származó vastagbél-explant tenyészetek kevesebb IL-10-t szekretáltak (C) és IL-12p40 (D) mint a vastagbél explant kultúrái Rag1 -/-. A vevő egerek megtekintéséhez kattintson ide a kép nagyobb változatának megtekintéséhez.

Korábban publikáltuk, hogy az adoptív T-sejt transzfer az Nfil3 -/-/Rag1 -/- kettős knockout recipiensekben (NRDKO) súlyos vastagbélgyulladást okoz a Rag1 -/- recipiens egerekhez képest (2. ábra) 11. Az NFIL3 negatívan szabályozza az IL-12p40-t egér vastagbél makrofágjaiban, tekintet nélkül IL-10 indukáló hatására. 13. Az IL-12p40 és az IL-10 diszregulációja az emberi IBD patogenezisében van. Az NDRKO recipiens egerek gyorsabb progressziót eredményeznek, például fogyást (2A) Látható. Néhány NRDKO recipiens egérben súlyos betegség alakult ki, amelynek következtében a bél prolapsusa volt (2 B). Az NRDKO befogadó egerek durva vastagbélei megvastagodnak és lerövidülnek, ami a gyulladásos sejtek nagy mértékű bevándorlását eredményezi a vastagbélbe, összehasonlítva a Rag1 -/- recipiens egerekkel (2C).

Összehasonlítva Rag1 -/- egerekben, amelyek nem funkcionális katalitikus p110 δ PI3K egységgel rendelkeznek nem limfocita populációkban (RKO/δ KD), a CD4 + CD45RB nagymértékben T-sejtek utánpótlása a betegség hasonló gyors és súlyos klinikai lefolyását indukálta NRDKO egerek (3) 12. A szövettani elemzés 3 hét után vastagbélszövet hipertrófiát, gyulladást, Tory sejt infiltrátumokat és kriptatályogokat (nyíl) mutat az RKO/δ KD recipiensben a Rag1 -/- recipienshez képest. (3A). Ebben a kísérletben a befogadó egereket 3 hétig eutanizálták, mivel jelentős számuk miatt az eredeti súlyuk 20% -át elveszítette. A hisztológiai pontszámok, amelyeket egy patológus megvakított a tesztcsoportokra, és amelyeket a laboratóriumunkban kidolgozott specifikus kritériumok alapján határoztak meg 12, a Rag1-hez képest magasabbak voltak az RKO/δ KD recipiens egerekben -/- recipiens egerek (3B). Ezenkívül a vastagbél explant tenyészeteiből származó spontán citokin termelés az RKO/δ KD recipiens egereknél csökkent IL-10 és IL-12p40 termelést mutatott a Rag1 -/- recipiens egerekhez képest (3C, D) 12. Ismételten megnövekedett IL-12p40 és csökkent IL-10 termelés kapcsolódik az emberi IBD 1 patogeneziséhez.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Vita

Itt leírjuk az egerekben a vastagbélgyulladás kiváltásának lépésenkénti protokollját a CD4 + CD45RB + T sejtek örökbefogadó átvitelével immunhiányos egerekben. C57BL/6 donor lépet és szingenikus Rag1 -/- recipiens egereket használtunk, bár más törzsek (pl. BALB/c, 129S6/SvEv, nem elhízott cukorbetegek (NOD)) és az immunhiány genetikai modelljei (pl. SCID, Rag2 -/- ) szintén alkalmazható a 4,14-16. Köztudott, hogy a háttér törzs befolyásolja az egerek kísérleti vastagbélgyulladásának súlyosságát. Ezenkívül az egérpopulációban az enterális mikroflóra jelentősen eltér az intézmények között, beleértve az ugyanazon intézményben lévőkét is. Míg 2 és 3 nem mutatta a colitis kialakulását Rag1 -/- egerekben az átvitelt követő 4 hét elteltével, tapasztalataink és más Rag1 -/- recipiensek tapasztalataink szerint a CD4 + CD45RB magas -T átvitele után 6 és 9 hét között nem mutatkozott clic betegség -Cellák 18-23. Ezt a változékonyságot a klinikai lefolyásban és a betegség expressziójában, és a lehető legalacsonyabban kell tartani, amikor a kísérleti vastagbélgyulladás modelljét intra- és inter-kísérleti inkonzisztenciára állítják be.

A protokoll optimalizálást igénylő lépései a 3. szakasz: A CD4 + T-sejtek gazdagítása és a 4. szakasz: A cellák címkézése és rendezése. A CD4 + T-sejtek dúsításának optimalizálása az alkalmazott mágneses rendszertől függ, és a gyártó utasításait kell követnie. A mágneses cellaszeparációs rendszer opcióit a A specifikus reagensek/kiegészítők táblázata listázott. Célszerű a CD4 + T-sejteket negatív szelekcióval dúsítani, mivel ennek a populációnak a közvetlen jelölése befolyásolhatja a sejtek fenotípusát. Számos antitestklón áll rendelkezésre a sejtek FACS jelölésére. Az antitestkoncentrációt (4.4. Lépés) úgy kell optimalizálni, hogy biztosítsa a specifikus festődést és a CD4 + CD45RB T-sejt populációk megfelelő szétválasztását a FACS alatt.

Itt leírjuk a krónikus vékonybél- és vastagbélgyulladás jól jellemzett adaptív transzfer egér modelljének módszertanát, amely hasonlít az emberi IBD-re 5. Ez a lépésenkénti protokoll kulcsfontosságú technikákat kínál ezen eljárások kutatási célú sikeres fejlesztéséhez. Ez különösen hasznos állatmodell az emberi IBD-ben, mert lehetővé teszi a betegség szinkronizálását és a különböző sejtpopulációk manipulálását. Az immunhiányos recipiens egereket azonban genetikailag módosítják anélkül, hogy kifejlett adaptív immunsejtek alakulnának ki, amelyek valószínűleg befolyásolják a downstream betegség folyamatait. Mindazonáltal az itt leírt módszer nagyon hasznosnak bizonyul majd az enterális mikroflóra, a veleszületett immunrendszer sejtjei és az adaptív immunszabályozó sejtek emberi IBD patogenezisében kifejtett hatásait meghatározó jövőbeli vizsgálatokban.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Köszönetnyilvánítás

Ezt a munkát az Amerikai Gasztroenterológiai Társaság (AGA) Kutatói Tudós Díja és az Amerikai Crohn és Colitis Alapítvány (CCFA) Karrierfejlesztési Díja (SZS), az NIH NIDDK F30 DK089692 (ECS) és az Észak-Karolinai Egyetem Gasztrointesztinális Biológiai Központja támogatta. és Betegségtámogatások P30 DK34987 (szövettani mag). Az UNC áramlási citometriájának alapvető eszközét részben az NCI Központ alaptámogatási támogatása (P30CA016086) támogatja az UNC Lineberger Átfogó Rákközpontjában. Köszönjük Lukas B. Borstnak, az észak-karolinai Állami Orvostudományi Főiskola kórszövettani elemzésében és immunhisztokémiájában nyújtott segítségét.