Az endodermális, máj differenciálódási potenciál
1 A felnőtt és az embrionális őssejtek in vitro és in vivo endodermális, májdifferenciálódási potenciálja Annika Wulf-Goldenberg biotechnológiai diplomát Berlinből, a berlini Műszaki Egyetem III. Folyamattudományi Karának mérnöki doktori fokozatának megszerzéséhez mutatta be. Ing. - jóváhagyott disszertációs doktori bizottság: elnök: Prof. Dipl.-Ing. Dr. U. Stahl Riporter: Prof. Dr. R. Lauster Riporter: Dr. habil. I. Fichtner riporter: Prof. Dr. J. Kurreck a tudományos megbeszélések napja: 2010. március 30. Berlin, 2010 D 83
2 Látod, Momo, mondta a Beppo utcaseprő, ez így szól: Néha nagyon hosszú út áll előtted. Szerinted ez olyan rettenetesen hosszú; ezt soha nem teheted meg, gondolod. És akkor rohanni kezd. És az ember egyre jobban siet. Minden alkalommal, amikor felnéz, láthatja, hogy nincs kevesebb, ami előttünk áll. És jobban próbálsz, megijedsz, és a végén teljesen kifulladsz és már nem tudsz. És az út még előtted áll. Nem teheti meg így. Soha nem szabad egyszerre az egész utcára gondolni, tudod? Csak a következő lépésre kell gondolnia, aztán a következő leheletre, a következő seprűvonásra. És mindig csak a következőre. Akkor öröm; ez fontos, akkor jól teljesíted a munkádat. És állítólag így van. Hirtelen rájössz, hogy lépésről lépésre megtette az egész utat. Észre sem vette, hogyan, és nincs kifulladva. Ez fontos. Michael Ende, a Momo-tól A szüleim számára, mert megtanítottál bátran és magabiztosan járni az utcán.
5 A sejtek 5 s u m e n g e s u n t. Nem sikerült egyértelmű differenciálódást funkcionális májsejtekké alakítani. A kondicionált táptalaj és az együtt tenyésztés kiválasztott in vitro differenciálódást előidéző körülményei lehetővé tették a CD34 + sejtek enyhe differenciálódását máj endodermális sejtekké. Az endodermális májdifferenciálódást az SA002 vonal humán embrionális őssejtjeiben in vitro rendszerek indukálhatják. A kiválasztott in vitro körülmények azt mutatják, hogy a ko-tenyészetben való közvetlen érintkezés hatékonyabban indukálhatja a differenciálódást, mint az őssejtekben lévő kondicionált közeg. Szükség van azonban a meglévő differenciálási protokollok fejlesztésére. A kifejlesztett in vivo modellek alapot szolgáltatnak az in vitro differenciált sejtek teszteléséhez és összehasonlításához.
11 Bevezetés 11 1 Bevezetés 1.1 A különböző őssejt-típusok és tulajdonságaik áttekintése Az őssejteket két kritérium (Verfaillie et al., 2002) alapján határozzuk meg: az önmegújulás képessége és a különböző sejttípusokká való fejlődési lehetőség. Az ontogenetikus kortól függően megkülönböztetünk két őssejt-típust: az embrionális és a felnőtt őssejteket, amelyek eltérő differenciálási potenciállal rendelkeznek a toti-, pluri-, multi- vagy unipotenciában (lásd 1. ábra). 1. ábra Őssejt-típusok differenciálódási képességükkel Egyetlen totipotens őssejt korlátlan differenciálódási potenciállal rendelkezik, és képes teljes organizmussá fejlődni. Pluripotens őssejtek
56 vizsgálat 56 apoptózist mutatott ki. Néhány gén részt vesz a sejtproliferációban, a citokinek kötődésében, a DNS-replikációban, a kemotaxisban és a vérképzésben (függelék). 10. táblázat: A CD34 + sejtek kiválasztott, szabályozott génexpressziós profiljai 10 napos tenyésztés után StemSpan táptalajban, kondicionált Gherardi táptalajban és kondicionált Sautin táptalajban, tenyésztetlen őssejtekhez viszonyítva. Term Gene no Stem Sppan-Medium Condi. Gherardi-Medium Kondi. Sautin táptalaj% p gén nincs% p gén nincs% p GO:
sejt% 5,54E% 1,41E-06 proliferáció GO:
mononukleáris %% sejtproliferáció GO:
mitózis% 1,19E% 3,54E% 8,55E-22 GO:
DNS-replikáció %% 5,24E + 10 GO:
sejtciklus% 2.16E% 3.23E% 7.13E-16 GO:
apoptózis% 5,56E% 4,75E% GO:
sejtdifferenciálás %% GO:
mechanorecept vagy differenciálás %% GO:
lizoszóma% 6,67E% 1,49E% 3,57E + 02 GO:
57 Eredmények 57 A kondicionált sautin táptalajban tenyésztett őssejtek hasonló számú gént expresszáltak, mint a kondicionált Gherardi táptalajban lévő őssejtek, 604 szabályozott gén és 1126 lefelé szabályozott gén a nem tenyésztett őssejtekhez képest. Főként a sejtciklushoz, a külső ingerhez, a hormonstimulációhoz és a szteroid bioszintézishez tartozó géneket szabályozták felül (Függelék). Ezenkívül a mikrotubulus-citoszkeletális szerveződéshez és a biogenezishez kapcsolódó géneket, például a MID1IP1 és a KIF11 bőségesen találták. Az epidermális fejlődés, a fokális adhézió, a véralvadás és a vérkeringés csoportjaiból származó gének szintén fokozottabban fejeződtek ki. Általában a sejtciklus, a DNS-replikáció és a kromoszómák magas transzkripciós profilú, a legkevesebb apoptózisos klaszterét találták ebben a táptalajban. A lefelé szabályozott jelátviteli utak az adherens junction, a sejtadhéziós molekulák és a B-sejt receptor jelátviteli utak voltak. Ezenkívül a maghoz, a transzkripciós faktor kötődéséhez, az angiogenezishez, az MHC I. osztályú kötődéshez és a kemokin termeléshez tartozó gének kevésbé expresszálódtak, mint a nem tenyésztett őssejtekben. A GO funkcionális csoportosulás kiválasztott génjeinek kifejezése:
58 Eredmények 58 11. táblázat Változások a GOTERM_BP_ALL adatbázisból kiválasztott gének génexpressziójában és a funkcionális csoportosításban: GO:
61 Eredmények 61 A korai endodermális markerek, mint például az SOX17, rövid tenyésztési periódus után expresszálódnak, a későbbi markerek, mint például az albumin, alacsonyabb szinten expresszálódnak az őssejtekben hosszabb tenyésztési periódus után. 12. táblázat: CD34 + őssejtek együttes tenyésztése AML12 sejtekkel. Az mrna-t bizonyos időpontokban izoláltuk, és a kiválasztott géneket félkvantitatív RT-PCR (TaqMan) segítségével határoztuk meg. Kimutatták, hogy az AML12 sejtekkel való együtt-tenyésztés a CD34 + sejteket szabályozza, csökkentve a CD34 génexpresszióját, és az endodermális markerek kissé növekednek. Gen 0d 7d 21d CD SOX FOXA AFP CEBPA HNF4A -/+ -/+ n.a. ALB -/+ -/+ + KRT n.a. KRT n.b. GATA4 - - n.a. CDH n.b. GJB1 -/+ ++ n.a. GJA n.b. KRT n.b. Jelmagyarázat: qrt-pcr: ++++ CT 0,0-4,0; +++ CT 4,1-8,0; ++ CT 8,1-12,0; + 12,1-16,0;
Ha az eredmények 64-gyel nőttek, az állatokat 1,6 Gy-vel besugároztuk 137 cézium-γ forrásból. A NOD/SCID/IL2Rγ null egerek is tolerálták ezt a sugárzási dózist. Az immunhiányos NOD/SCID egerek csecsemőmirigyei nagyon kicsiek voltak, összehasonlítva immunokompetens NMRI egérrel. Nem mutattak egyértelmű különbséget a velő és a kortikális zónákban, és hipoplasztikusak voltak (12. ábra). Az immunhiányos kísérleti állatokban csak nagyon kevés limfocita volt látható perivascularisan a thymus szövetében. A NOD/SCID/IL2Rγ null egerek csecsemőmirigyje hasonlított a NOD/SCID egerek csecsemőmirigyjéhez. a b 12. ábra Immunokompetens NMRI egér (a) és immunhiányos NOD/SCID egér (b) csecsemőmirigyének hisztopatológiai vizsgálata.
66 eredmény 66 a% HLA-I pozitív humán sejt (normalizált), 7 3,2 3,1 2,2 1,7 1, min 30 b 80 A 1 A 2 A 3 A 4 60 A1,1 A Átlagos AB 1 B 2 20 B 3 B 4 Átlagos B 0% emberi sejtek c 20% emberi sejtek Csontvelő PBS SCF napok az iv alkalmazás után Lép PBS SCF napok az iv alkalmazás után 13. ábra Szisztémásan alkalmazott CD34 + sejtek időfüggő vértisztulása NOD/SCID egerekben ( a). 4x10 5 CD34 + sejtet injektáltunk iv. besugárzott egerekbe transzplantálták. A kezeletlen (szilárd, kék vonal) vagy az SCF által előkezelt (szaggatott, piros vonal) sejteket FACS-val elemeztük az egér vérkeringésében az alkalmazás után 1, 5 és 20 perc elteltével. Meghatároztuk a bevitt sejtek humán HLA-I pozitív sejtjeinek számát. Az eredmények összesen három kísérlet eredménye. Kezeletlen és SCF előkezelt őssejtek hosszú távú beültetése NOD/SCID egerekben (b, c). A kezeletlen és SCF előkezelt sejteket iv. A csontvelőt (b) és a lépet (c) áramlási citometriával elemeztük a humán specifikus HLA-I antitesttel. Az értékek csoportonként 6-9 egér átlagai ± SEM.
88 A b c 2µm d e 27. ábra Pluripotencia markerek expressziója differenciálatlan SA002 őssejteken. Az SSEA-4 (a), a TRA-1-60 FITC (b) és az Oct-4 (d) immunocitometriás meghatározása. Differenciálatlan SA002 sejtek ultrastrukturális szinten (c). A sejteket nagy mag/plazma arány jellemzi (sötét mag). SA002 őssejtek karogramja p41; Giemsa folt (e). A leírt 47, XX + 13 kariotípus kimutatható volt a sejtek számára. A stabil kariotípus hosszú távú tenyésztés során történő ellenőrzéséhez kariotípus-elemzéseket végeztünk az embrió SA002 őssejtvonalán. A karyogram elemzését és meghatározását az IMMD Berlin cég végezte. Az őssejtvonalat 18. passzussal tenyésztettük, és az első elemzésig 23-szor mechanikusan átalakítottuk. Az SA002-