Bakteriális genomika és metagenomika klinikai alkalmazásai és orvosi jelentősége - áttekintés

összefoglaló

Az új szekvenálási technológiák lehetővé teszik a genomiális szekvenciák gyors és megfizethető megszerzését olyan alkalmazásokhoz, mint a) diagnosztikai PCR-ek vagy szerológiai tesztek kifejlesztése; b) virulencia faktorok és antibiotikum rezisztencia gének kimutatása és c) a kórokozó baktériumok epidemiológiája. Így a baktériumok genomikája hasznos a mikrobiológusok, a fertőző betegségek és a kórházi higiénia szakemberei számára. A minta mikrobiális összetételének, az úgynevezett metagenomikának a meghatározása az új szekvenálási technológiák másik alkalmazása. Az emberi mikrobiota tanulmányozása hasznos a baktériumok elhízásra, asztmára vagy cukorbetegségre gyakorolt hatásának megértéséhez. A metagenomika valószínűleg speciális diagnosztikai elemzéssé válik.

Bevezetés

A szekvenálás, amely lehetővé teszi a nukleotidbázisok DNS-ben való egymás utáni meghatározását, forradalmasította a tudományos kutatást. 1977-ben Sanger és mtsai. enzimszintézissel szekvenálta a bakteriális vírus (ΦX174) első genomját. 1 Azóta jelentős technikai fejlesztések lehetővé tették az úgynevezett "nagy áteresztőképességű" szekvenálási technológiák (NTS) megjelenését (1. táblázat). Ezek az NTS jelentősen megnövelte a szekvenálás sebességét, és ezzel egyidejűleg csökkentette annak költségét. Újabban olyan kompaktabb szekvenerek modelljei jelentek meg, mint a Roche/454 GS Junior, az Illumina MiSeq vagy az Ion torrent PGM. 2 Olcsóbbak, de kevésbé produktívak, ennek ellenére elegendő kapacitással rendelkeznek a diagnosztikai bakteriológiai laboratóriumok számára, tekintettel a baktériumok genomjának méretére (körülbelül 1000-szer kisebb, mint az emberi genom). A nagy áteresztőképességű szekvenátorok használata a szekvenált baktériumok genomjainak számának exponenciális növekedéséhez vezetett (1. ábra). Így a jelenleg rendelkezésre álló 26 000 genom 98% -a szekvenálódott az elmúlt hét évben. A mikrobiális közösségekről rendelkezésre álló adatok szintén gyorsan növekednek, a metagenomikus megközelítéseknek köszönhetően.

A különböző nagy áteresztőképességű szekvenálási technológiák összehasonlító táblázata

Genomika vagy metagenomika: hogyan kell elindulni ?

A baktériumok genomikája, amely lehetővé teszi a baktériumok genomjainak tanulmányozását (szerkezetük, evolúciójuk, a kódolt gének funkciója és szabályozásuk), elsősorban egy adott baktérium izolálásán és tenyésztésén alapul. A tiszta tenyészet megszerzése elengedhetetlen lépés ahhoz, hogy a baktériumtörzs adott fenotípusát hozzákapcsoljuk géntartalmához, különösen annak virulenciájának, patogenitásának vagy rezisztenciájának specifikus tanulmányozásához.

A baktériumok túlnyomó része (több mint 99%) azonban nem termeszthető. 3 Így egy baktériumközösség egészének tanulmányozása érdekében ma már lehetőség van az adott közegben jelen levő összes baktérium DNS-ének szekvenálására (talaj, víz, emberek és állatok emésztőrendszere, mintaklinikák ...). Ez a "metagenomikának" nevezett megközelítés a jelenlévő mikroorganizmusok sokféleségéről és relatív bőségéről mesél nekünk.

Amint azt a 2. ábra szemlélteti, a baktérium teljes genomjának szekvenálását vagy a metagenomikus szekvenálást négy fő lépésben hajtjuk végre: a) a genomi DNS kivonása akár tiszta baktériumtenyészetből, akár közvetlenül a mintából; b) DNS-szekvenálás előzetes amplifikációval vagy anélkül; c) a szekvenált genom (ok) bioinformatikai összeállítása és d) a kapott szekvenciák elemzése.

A bakteriális genom szekvenálásának különböző szakaszai

A genomika alkalmazásai a klinikai mikrobiológiában

Az NTS új alkalmazásai jelennek meg az orvosi területen (2. táblázat), például: hatékonyabb molekuláris diagnosztikai eszközök kifejlesztése, a járványok mélyreható vizsgálata, egy baktériumtörzs patogenitásának vizsgálata, valamint a virulencia faktorok (viruloma) vagy antibiotikum rezisztenciát kódoló gének (rezisztóma) kimutatása. A 4,5 NTS megközelítés lehetővé teszi a szóban forgó mikroorganizmus átfogó elemzését, és a jövőben ugyanolyan gyorsan biztosítja ezeket az eredményeket, mint a hagyományos módszerek.

Példák klinikai alkalmazásokra új szekvenálási technológiák (NTS) alkalmazásával

Molekuláris diagnosztikai eszközök fejlesztése

Az NTS kiterjesztése lehetővé tette olyan eszközök kifejlesztését a bakteriális fertőzések megelőzésére és diagnosztizálására, beleértve az érzékeny és specifikus PCR-eket is. 6–8 Így Yang és mtsai. széles spektrumú PCR-t fejlesztett ki 27 Acinetobacter baumannii törzs genomiális összehasonlítása alapján annak érdekében, hogy javítsa a baktériumfaj klonális és kialakulóban lévő patogén törzseinek felügyeletét. Nemrégiben azonosítottunk egy meningococcus (Neisseria meningitidis) polimorf törzset, amelyet a CHUV-nál alkalmazott diagnosztikai PCR nem mutatott ki. 9 E törzs génjeinek összehasonlítása 183 egyéb rendelkezésre álló N. meningitidis törzs génjével lehetővé tette tizenegy célgén azonosítását és a N. meningitidis fajra specifikus diagnosztikai PCR-ek kifejlesztését. 10.