Béta-thalassemia-genetikai teszt (HBB) - Synevo
A béta-thalassemiák az autoszomális-recesszív genetikai transzmisszióval járó betegségek csoportját jelentik, amelyet a globin β-láncainak alacsony szintézise jellemez.
A β gén klaszter a 11. kromoszómán helyezkedik el, 50 kb hosszúságban húzódik, és a következő sorrendben tartalmazza: egy epsilon gént (ε), 2 gamma gént (úgynevezett G γ és A γ), egy pseudogént β (ψβ), egy a delta (δ) gén és a β-globint 1 kódoló β gén (az úgynevezett HBB). Mindegyik gén 3 fehérjét (exont) kódoló szekvenciával és 2 olyan régióval rendelkezik, amelyeknek nyilvánvalóan nincs szerepük a fehérjeszintézisben (intronok = közbeiktatott szekvenciák), 5 'és 3' szekvenciák határolják őket, amelyek szintén nem avatkoznak be a transzlációs folyamatba. Minden gén 5'-végén található a promoter, amely szekvencia szükséges a transzkripció megindításához. A β gén promoter 3 szekvenciát tartalmaz: TATA box, CCATT box és duplikált CACC motívumok. Az exonok és az intronok egyaránt szenvednek a jelátvevő RNS-be történő DNS-transzkripció jelenségétől; ezt a folyamatot olyan transzkripciós faktorok vezérlik, amelyek kötődnek a promoterekhez és az upstream vezérlő elemekhez - fokozókhoz -, amelyek nagymértékben növelik az átírás sebességét. Így a β-globin gének egy fő intenzívebb elem hatása alatt állnak, az úgynevezett β-lokusz kontroll régiónak (β-CSF) (lásd az ábrát) 1; 3 .
Az átírási jelenség a következő lépéseket tartalmazza:
- a tényleges transzkripció: az eredmény a gén RNS-másolata, amely tartalmazza az exonok és az intronok komplementer szekvenciáit is;
- kapszulázás és poliadenilezés (sapkázás + poliadenilezés): speciális nukleotidok kapcsolódása az RNS 5'- és 3'-végéhez;
- splicing: az intronok eltávolítása az mRNS-ből; az exonoknak megfelelő RNS-szekvenciákat ezután együtt "veleszületjük" 3 .
A béta-thalassemia gyakrabban fordul elő a mediterrán medence populációiban, de más etnikai csoportok is érintettek lehetnek. A hiba súlyossága változó. A normális embereknek 2 allélja van a β-globinra, ezért a β-thalassemia heterozigóta vagy homozigóta állapotban fordulhat elő. Mivel a β-thalassemiához nagyszámú mutáció kapcsolódik, lehetségesek a vegyület heterozigozitása is, amelyek akkor fordulnak elő, amikor egy személynek 2 mutáns génje van.
A β-thalassemia két tág kategóriáját írják le:
-β vagy thalassemia (béta nulla thalassemia): azzal jellemezhető, hogy nincs kóros β-gén expressziója vagy ritkábban deléciója; amikor a hiba homozigóta állapotban jelenik meg (β o/β o), a β-láncok és implicit módon a hemoglobin A szintézise teljesen érintett;
-β + thalassemia (béta pl. thalassemia): a kóros β-gén csökkent (de nem hiányzó) expressziója jellemzi; amikor a hiba homozigóta állapotban jelentkezik, bizonyos mértékű hemoglobin A 1 termelődik; 5 .
A β-thalassemia összetett heterozigótáinak 2 különböző β o vagy β + génje lehet, vagy β + és β 0 gén egyaránt (β +/β o).
A klinikai kép rendkívül változó. A β-thalassemia heterozigóta állapota, más néven β-thalassemia vagy β-thalassemia minor, a legtöbb esetben klinikailag tünetmentes állapot. A β-thalassemia homozigóta állapota vagy vegyület heterozigozitása általában súlyos klinikai fenotípushoz vezet, az úgynevezett β-thalassemia majorhoz, amelyben az érintett egyének függenek a vérátömlesztéstől. A köztes β-thalassemia kifejezés magában foglalja a közepes súlyosságú klinikai állapotokat a kisebb és a nagyobb formák között; Az érintett emberek tüneti tünetek, és időnként vérátömlesztést igényelhetnek, de ezek nem elengedhetetlenek az élet fenntartásához 1 .
Genetikai tesztelés
Jelenleg több mint 200, a β-thalassémiához kapcsolódó mutáció ismert, amelyek különféle PCR technikákkal, szintetikus oligonukleotidokkal történő hibridizációval vagy szekvenálással detektálhatók. .
A legtöbb esetben ezek olyan mutációk, amelyek a HBB génben vagy annak közelében fordulnak elő (egyetlen nukleotid szubsztitúció, deléció vagy oligonukleotid inszerció). Az érintett genetikai eseménytől függően háromféle mutációt írnak le:
-befolyásolja a β-globin transzkripciót;
-amely befolyásolja az mRNS feldolgozását (splicing vagy polyadenylation jelenségek);
-amelyek az mRNS rendellenes transzlációját eredményezik (nonszensz vagy olvasási keretmutációk) 3 .
Az esetek alacsony százaléka a gén vagy az 1; .
A kiváltott hiba súlyosságát tekintve a HBB génmutációk két nagy kategóriába sorolhatók:
Ajánlások a mutációelemzéshez
-a prognózis meghatározása a klinikai fenotípus (a fő köztes thalassemia molekuláris differenciálódása) szempontjából;
-a nagy kockázatú családok hordozóinak nyomon követése;
-a béta thalassemia prenatális diagnózisa 5; 6 .
Begyűjtött minta - vér jön 4 .
Betakarítási konténer - antikoagulánsként EDTA-t tartalmazó vakutainer 4 .
Betakarított mennyiség - amennyit a vákuum megenged 4
Az elutasítás okai megpróbálni - heparin antikoagulánsként történő alkalmazása; koagulált vagy hemolizált minták 4 .
Tesztstabilitás - 7 nap 2-8ºC-on 4 .
Módszer - komplett HBB 4 szekvenszer .
Az eredmények értelmezése
Béta-thalassemia ország (heterozigóta állapot)
A β-thalassémiában szenvedők általában tünetmentesek; azonban lehetséges, hogy a hematopoietikus stressz (terhesség, interakciós fertőzések) esetén vérszegénységgel kapcsolatos megnyilvánulások jelennek meg. Néhány betegnek splenomegalia lehet.
A hemogram az eritrocita-sorozat jellegzetes változását mutatja: a hemoglobin érték enyhe csökkenése, az eritrociták számának növekedése, a VEM és HEM eritrocita indexek alacsony értékei, az eritrocita eloszlás szélessége általában normális. A hematológiai változók átlagosan eltérnek a β 0 és β + országokban, bár jelentős átfedések lehetnek. Azokban az esetekben, amikor az α-thalassemia együtt jár, a hematológiai rendellenességek kevésbé kifejezettek.
A perifériás vér kenetén mikrocitózis, hipokrómia, poikilocytosis, "cél" vörösvértestek mellett bazofil szúrások figyelhetők meg. A csontvelői vizsgálat megnövekedett cellularitást mutat az erythroid hyperplasia miatt.
A diagnózis a HbA2 megnövekedett százalékának kimutatásán alapszik hemoglobin elektroforézissel vagy kromatográfiás módszerrel (HPLC). A betegek körülbelül egyharmada-fele a HbF megnövekedett százalékával társul.
A hemoglobin A2 aránya korrelál a béta-thalassemia mutáció típusával. Így a β 0 vagy a súlyos β + -talassémia heterozigozitásának legtöbb esetben 4-5% HbA2 százalékos arányt regisztrálnak, míg a β + -talassemia enyhe formáiban általában 3,6-4,2%. Magasabb százalékos arány található azokban az országokban, amelyek a HBB gén 5'-részének deléciójával társulnak, valamint a promoter vagy az iniciációs kodon mutációi esetén.
A β-thalassemia okai normál HbA2 esetén
A HbA2 normál százalékos arányú β-thalassemia formái is vannak, úgynevezett csendes β-thalassemia. Például a terminális kodon 6, 3 'helyzetéből származó C → G mutáció esetén átlagosan 2,4% -os százalékot találunk.
Ha egy személynek béta-thalassémiára utaló vörösvértest-mutatói vannak, de a HbA2 százalék nem emelkedik, fontos kizárni a δβ-thalassémiát, a Lepore-hemoglobinopátiát és az α-thalassémiát. Előfordulhat γδβ-thalassemia, de ez az állapot nagyon ritka. Egyes vashiányos vérszegénységben szenvedő betegeknél atípusos eritrocita indexek lehetnek; különösen a gyermekeknél vashiányos vérszegénység lehet, amelyet megnövekedett eritrociták száma kísér.
Az alacsony ferritinszint vashiányra utal, de nem zárja ki a béta-thalassemia diagnózisát.
A heterozigóta állapotban előforduló kisebb vagy hiányos hematológiai rendellenességekkel társuló HBB mutációk fontos diagnosztikai problémákat vetnek fel; azonosításuk azért szükséges, mert klinikailag jelentős állapotot okozhatnak homozigóta vagy heterozigóta vegyületekben. Az ilyen típusú mutációk két csoportra oszthatók:
-mutációk, amelyek "néma talaszémiát" okoznak vörösvértest-indexekkel és normális HbA2-százalékkal;
-normális HbA2-vel és megváltozott eritrocita-indexekkel "szinte néma thalassemiát" okozó mutációk.
Ezeket a formákat csak genetikai vizsgálatokkal lehet kimutatni. Egyes mutációk, például a görög populációban +1480 C → G, annyira enyhék, hogy szinte mindig "néma talaszémiát" okoznak. A thalassemia ezen formájának leggyakrabban felelős mutációi -101 C → T és -92 C → T, amelyek a következő átlagértékekkel társulnak: VEM = 83,9 fL, HEM = 28,6 pg és HbA2 = 3,4%. A "szinte csendes thalassemia" egy kis mutációcsoportból származik, például CAP + 1 A → C Indiában és esetenként IVS-6 T → C a Földközi-tengeren. Az IVS-6 T → C heterozigótái a következő értéktartományokat mutatják: VEM = 60-78 fL és HbA2 = 3,2-4-6%.
A vashiány csökkenti a HbA2 százalékos arányát mind a globinhiányos, mind a béta-thalassémiában szenvedőknél. Ez nem jelent problémát a HbA2 jelentős növekedésével járó genetikai rendellenességben szenvedők számára, de azok számára, akiknek a HbA2 vashiány kisebb mértékű növekedésével járó enyhe mutációi vannak, elfedik a béta-thalassemia országot. Emiatt ajánlott súlyos vagy közepesen súlyos vashiányos vérszegénységben szenvedő betegeknél először korrigálni a vashiányt, ezt követően, ha az eritrocita indexek változása továbbra is fennáll, meg kell mérni a HbA2 százalékát. Kivételt képeznek ez alól az ajánlás alól azok a terhes betegek, akiknél a béta-thalassemia diagnózisát azonnal fel kell állítani. Ebben a helyzetben meg kell vizsgálni a partnert; ha azt béta-thalassemia országban észlelik, akkor a genetikai teszteket fontolóra veszik a határon HbA2 szintet mutató terhes nőknél.
A megaloblasztos vérszegénység a HbA2 szintjének csökkenéséhez is vezethet, és zavarhatja a β-thalassemia diagnózisát.
A megváltozott eritrocita-indexek normális HbA2-szinttel való társulása a δ-thalassemia és a β 0 vagy β + mutáció együttes létezéséből is adódhat, amely a HbA2 magas százalékát indukálja (megtalálható a gyíkokban és a ciprusokban). A Knossos-hemoglobin a β-thalassemia néhány esetéért is felelős, normál HbA2-szint mellett.
Az enyhe β-thalassemia mutáció (például CAP + 1 A → C) és az α 0-thalassemia törzs vagy az α + -talassemia homozigóta státusának együttes jelenléte miatt a β-thalassemia erősségének diagnózisát gyakran el kell hagyni.
Β-thalassemia ország normál eritrocita indexekkel és megnövekedett HbA2-vel
Néhány heterozigóta beteg esetében az enyhe β-thalassemia bizonyos változatai normális eritrocita indexek jelenlétében megemelhetik a HbA2 szintet; ezt az állapotot a -101 C → T mutációval rendelkező betegeknél találták meg.
Ezenkívül az α és a β-thalassemia együttélése normális eritrocita indexekhez vezethet a globin láncok kiegyensúlyozottabb szintézise révén, de a HbA2 megnövekedett százalékával. Ez a változás különösen gyakori azoknál a betegeknél, akiknél két α gén deléciója történt, vagy nem deléciós α-thalassemia.
A szerzett rendellenességek, például a májbetegségek által kiváltott rendellenességek, növelhetik az eritrocita index értékét a β-thalassémiában szenvedő betegeknél.
Mindezek a példák szemléltetik a β-thalassemia országos eseteinek összetettségét és azonosításuk nehézségeit, a genetikai tesztelés néha az egyetlen vizsgálat, amely megerősíti a diagnózist 1 .
Bár a β-thalassemia mutációval szemben heterozigóta emberek többségének klinikai-patológiai jellemzői kisebb talaszémiának minősülnek (megváltozott hematológiai kép klinikai megnyilvánulások hiányában), néhányukban splenomegalia, vérszegénység, sárgaság és epekő alakul ki, a β-thalassemia nevű állapot. A fenotípus hasonló a β-thalassemia köztitermékhez, és mind az nem hatékony eritropoézishez, mind a hemolitikus komponenshez kapcsolódik. Jellemző az inklúzióval rendelkező erythroblastok jelenléte (amelyek felesleges α-láncokból és β-abnormális láncokból állnak).
Több mint 30 olyan allélt írnak le, amelyek a domináns β-thalassemia fenotípust indukálják, beleértve a 2. vagy 3. exon 3'-régiójában található mutációkat, amelyek jelentős mennyiségű mutáns mRNS-t okoznak. Ennek következtében csonka vagy hosszúkás β-láncok szintetizálódnak, rendkívül instabilak, amelyek normál α-láncokkal együtt kicsapódnak 1 .
Különféle genetikai rendellenességek által okozott klinikai fenotípusra utal. A β-thalassemia intermedier súlyossága a növekedési retardációval és a csontdeformitásokkal járó klinikai állapottól kezdve, amelyben a túlélés vérátömlesztés nélkül ritkán lehetséges, az enyhébb formákig, hasonlóan a β-thalassemia-hoz, de magasabb fokú. vérszegénység és splenomegalia.
Komplikációk fordulhatnak elő, mint például: hipersplenizmus, epekövek, vas túlterhelés, kompressziós jelenségek, amelyeket extramedulláris hematopoietikus szövetek tömegei gyakorolnak a létfontosságú szervekre.
A hematológiai kép olyan rendellenességeket tartalmaz, amelyek hasonlóak a tipikus heterozigóta β-thalassemia által kiváltottakhoz, de súlyosabbak; mikrocitózis mellett hypochromia, anisocytosis, poikilocytosis, basophil defektek, polichromatophilia és keringő eritroblasztok fordulhatnak elő.
A hemoglobin elektroforézis vagy a HPLC a HbA2 (magasabb, mint a β-thalassemia országban) és a HbF szintjének emelkedését jelzi.
Közbenső β-thalassemia fordulhat elő olyan betegeknél, akiknek egyik vagy mindkét rendellenes β-génjük van. Azok, amelyek homozigóta vagy heterozigóta vegyületek a β-thalassemiás allélek számára, mutációkkal társulnak a β + -talassemia enyhe formáihoz, vagy enyhítő tényezőkkel rendelkeznek, mint például az α-talaszémiás erő együttélése vagy olyan mutáció, amely fokozott γ láncszintézishez vezet. vérképző stressz. Akiknek csak egy kóros β-génje van, vagy a β-thalassemia domináns formája van, vagy olyan mutációkkal társulnak, amelyek súlyosbítják a globin lánc egyensúlyhiányát, például a tripla α vagy a négyszeres α homozigóta vagy heterozigóta státusza (α gének 3 vagy 4-gyel szorozva) alkalommal).
A genetikai teszt megkönnyíti azon rendellenességek azonosítását, amelyek meghatározzák a β-thalassemia köztes fenotípust 1; 5 .
A vérátömlesztéstől függő, β-thalassemia mutációkban szenvedő vegyes homozigóta vagy heterozigóta betegeknek β-thalassemia major nevű klinikai állapota van.
A betegséget gyakran az első életévben ismerik fel, 3 hónapos kortól kezdve; súlyos vérszegénység jellemzi, amelyet felgyorsult eritropoezis kísér, mind a medulláris, mind az extramedulláris szektorban. A hematopoietikus expanzió súlyos csontdeformációkhoz vezet, különösen a koponya és az arc csontjai; az extramedulláris hematopoiesis hatalmas hepatosplenomegalia kialakulásához vezet.
Az eritrocita sorozat a következő értékekkel rendelkezik: Hb = 3-7 g/dl, VEM = 50-60 fL, HEM = 12-18 pg. A vérkenet markáns mikrocitózist, hypochromiát, markáns anisocytosisot és poikilocytosisot, bazofil defekteket, keringő eritroblasztokat tartalmaz hemoglobinizáció és dyserythropoietic jellemzők.
Homozigóta vagy vegyület heterozigóta esetén a β0-thalassemia (β 0/p 0) hemoglobin elektroforézis vagy HPLC technika csak HbA2 és HbF jelenlétét jelzi; amikor a betegek homozigotitással rendelkeznek β + -talassemia (β +/β +) vagy vegyület heterozigozitással szemben β 0 és β + -talassemia esetén (β +/β 0), a HbA szintén 35% -ban van jelen.
A β-thalassemia majorban a HbA2 százaléka normális, magas vagy alkalmanként alacsony 1; 2 .
1. Barbara J. Bain. Hemoglobinopathia diagnózis. Blackwell Science, 2001, 7-9; 73-93.
2. Caterina Borgna Pignatti, Renzo Galanello. Thalassemiák és a hemoglobin szintézis kapcsolódó rendellenességei. In Wintrobe`s Clinical Hematology, 11. kiadás, Lippincott Williams & Wilkins, 2004, 1083-1118.
3. Cornel Mironel Niculae. Átírás (átírás). Bioinformatika. fpce9.fizica.unibuc.ro/bioinfo/transcrierea.htm. Referencia típusa: Internetes kommunikáció.
4. Synevo Laboratórium. Az alkalmazott munkatechnika konkrét hivatkozásai 2010. Ref.
5. Renzo Galanello, Antonio Cao. Béta-thalassemia. Gene Review, 2007. www.ncbi.nlm.nih.gov. ReferenceType: Internetes kommunikáció.
6. Talmaci R, -thalassemiák molekuláris diagnózisa. A biotechnológia fejlődése, II. Kötet. Eds Ars Docendi, 179-188, 2002.