Élettartam mérése Drosophila melanogaster Protokollban (németre fordítva)

Összegzés

A Drosophila melanogaster egy erőteljes modell a hosszú élettartam-szabályozás molekuláris alapjainak feltárására. Ez a protokoll megtárgyalja az élettartam reprodukálható, népességalapú mérésének előállításának lépéseit, valamint a lehetséges buktatókat, és hogyan kerülhető el.

Absztrakt

Az öregedés olyan jelenség, amely szinte minden élőlényben stacionárius fiziológiai romlást eredményez, amelyben vizsgálták, ami csökkent fizikai teljesítőképességhez és a betegségek kockázatának növekedéséhez vezet. Az egyéni öregedés a népesség szintjén az életkorral összefüggő mortalitás növekedéseként jelenik meg, amelyet a laboratóriumban gyakran az azonos korú emberek nagy kohorszának élettartamának figyelemmel mérnek. Kísérletek annak számszerűsítésére, hogy a genetikai vagy környezeti manipulációk milyen mértékben befolyásolják az egyszerű modellorganizmusok élettartamát, kiemelkedően sikeresek voltak az öregedés taxonok szempontjából releváns szempontjainak megértéséhez, valamint új stratégiák inspirálására az élettartam meghosszabbítására és az emlősök korral járó betegségek megelőzésére megmaradtak .

Jegyzőkönyv

Javasoljuk, hogy a protokollban 4 ° C-on megjelenő kísérleti ételeket, élesztő pasztát és szőlőagar lemezeket tárolja, és 1-2 hónapon belül használja fel, amennyiben a forma és a szárazság nincs meghatározva. A lárvák és a kifejlett állapot normál környezeti feltételei közé tartozik a 25 ° C-os inkubátorban repül, 12:12 órás világos-sötét ciklus mellett 60% relatív páratartalommal.

A. A kísérleti főzés előkészítése

  1. A lárvák növekedéséhez egy módosított Caltech Medium 5 táptalajt használunk, amelyet ebben a protokollban CT-ként rövidítünk.
  2. Diétát ajánlunk a felnőtt Drosophila (SY) számára, amely cukrot (szacharózt) és élesztőt (liofilizált egész sörélesztő) tartalmaz 2% -os agar bázisban, amelyet forraltak, antibiotikumokkal és gombaellenes szerekkel kiegészítettek és diszpergáltak. (10 ml injekciós üvegenként) 6. A táplálékot tárolás előtt 12–24 órán át hagyni kell megszilárdulni és elpárologni. Mivel a tápanyag-környezet jelentősen befolyásolhatja a hosszú élettartamot, a konzisztencia főzési módszerei elengedhetetlenek mind a kísérleten belül, mind a kísérletek közötti összehasonlításhoz.
  3. Ha egy farmakológiai ágenst kell adni a felnőtt ételhez, akkor ezt a gyógyszert összekeverhetjük egy kis adag ételben, és rétegeket (2 ml) az élelmiszer felületére vivőanyag rétegeket tartalmazó kontroll injekciós üvegekkel.

2. Készítsen élő élesztőpasztát

Keverjen össze 5-6 ml vizet 3 g száraz élesztővel és alaposan keverje össze. Az élesztő paszta konzisztenciájának meg kell egyeznie a sima mogyoróvajéval.

3. Készítsen elő egy szőlő agar lemezt

  1. Tegyen egy csomag szőlőagar előkeveréket 500 ml desztillált vízbe 1000 ml-es palackba, és kövesse a csomagoláson található utasításokat a szőlőagar-keverék feloldásához.
  2. Óvatosan öntsön egy vastag keverékréteget 100 mm-es Petri-csészékbe, elkerülve a buborékosodást. Egy Premix csomag körülbelül 14 szőlőagar lemezt eredményez.
  3. Hagyja a közeget szobahőmérsékleten lehűlni és megszilárdulni, fedéllel 15 percig. A lemezeket 4 ° C-on tárolhatjuk, műanyag csomagolásba csomagolva vagy azonnal felhasználhatjuk.

4. Szinkronizált tojások gyűjtése

Az ebben a protokollban használt összes táptalajnak, azaz az élesztőnek, a szőlőagar lemezeknek, a CT-nek és a 10% SY ételeknek szobahőmérsékleten kell lenniük.

5. Életkornak megfelelő felnőtt legyek gyűjtése

  1. A felnőttek általában az első naptól kezdve 9-től kelnek ki. Dobja ki az első napon előkerült legyeket, és egy éjszakára tegye vissza az üvegeket az inkubátorba. Ezzel a gyakorlattal elkerülhetőek a véletlenszerű kiválasztások a kezdeti megjelenésekhez és a szinkronizált legyek maximális számának összegyűjtéséhez.
  2. 16-22 órával később az a napos felnőtt 10% SY ételt tartalmazó palackokba repül. Szükség esetén másnap újabb adagot lehet gyűjteni.
  3. Repül vissza az inkubátorba, és hagyja, hogy a legyek két napig elérjék ivarérettségüket és párosodjanak. Írja fel az átadás napját a 10% SY palackokra, mint a felnőttkor első napjára.

6. A legyek válogatása és a hosszú élettartamú kísérlet beállítása

  1. Érzéstelenítsen kis légycsoportokat az érzéstelenítő párnán, majd a férfiakat és a nőket két ecsettel csoportosítsa. A CO 2 használata során kritikus fontosságú a lehetséges hosszú távú egészségügyi problémáknak való kitettség minimalizálása, amelyek veszélyeztethetik a hosszú élettartamú kísérlet integritását.
  2. Helyezzen 30 azonos nemű legyet egyedi fiolákba. Feltételezve, hogy a populációban és az egészséges utódokban nincsenek kiegyensúlyozó kromoszómák, minden palacknak ​​minden nemből hozzávetőlegesen 3-4 fiolát kell termelnie. A legyek alikvotálása az egyes injekciós üvegekbe nem haladhatja meg a 3-4 percet, így a legyeket csak 9-10 percig éreztetik altatással.
  3. Ismételje meg a 6.1–6.2. Lépéseket, amíg minden nemnél és kísérleti terápiánként 8–10 injekció ismétlődik.

7. A hosszú élettartamú kísérlet nyomon követéséhez állítsa be az Excel táblázatot

  1. Javasoljuk az injekciós üveg helyzetének randomizálását, nem pedig az injekciós üvegek kísérleti állapot szerinti csoportosítását, annak érdekében, hogy elkerüljük az inkubátorban lévő injekciós üveg helyzetének eltorzulását, és a homályos homály eltakarja a kísérletet. Ehhez először egy táblázatos programban rendeljen hozzá egy randomizált numerikus azonosítót minden egyes fiolához, majd az üvegeket azonosító szám szerint rendelje hozzá a tálcákhoz. Ha a dLife kísérletkezelő szoftvert használja, kövesse a kísérletbeállítási utasításokat az egyes üvegek azonosító számának előállításához.
  2. (Opcionális) Ha RFID-olvasót vagy vonalkód-olvasót használ a dLife-szel együttmûködve, csatoljon egy RFID- vagy vonalkód-címkét minden fiolához, és társítsa a címkét az ampullával a dLife-ben levõ azonosítóval. A program minden egyes fiolát felismer, ha olvasóval leolvassa őket, és elindítja az adatok megfelelő helyre történő rögzítését egy táblázatban. A címkeolvasó használata a dLife-lel együtt csökkenti az adatgyűjtési időt és a rögzítés során elkövetett hibákat.

8. A hosszú élettartam-kísérlet fenntartása

A friss ételeket tartalmazó injekciós üvegeknek szobahőmérsékleten kell lenniük minden átadáshoz.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Reprezentatív eredmények

A protokoll egyszerűsített sémája benne van 1. ábra, ahol fontos lépések körvonalazódnak. A protokoll szinkronizálási része életkorhoz igazított felnőtt legyeket igényelhet a különböző vizsgálatokhoz.

A vad típusú legyek tipikus túlélési arány görbéit a 2a. Ábra a dLife kísérletkezelő szoftver segítségével látható (2b., C. Ábra). A felnőtt férfiak többnyire rövidebb életet élnek, mindkét populáció átlagosan és átlagosan 50 napnál hosszabb élettartamot ér el 10% SY étel mellett 25 ° C-on. Vegye figyelembe, hogy a túlélő magas marad a kísérlet elején, majd exponenciálisan esik.

A Drosophila élettartamát befolyásolják a környezeti feltételek, például a hőmérséklet és az étrend. 3a. Ábra azt mutatja, hogy a felnőtt férfiak jellemzően lényegesen kevesebbet élnek a hőmérséklet emelkedésével. Hasonlóképpen, az étrend hatása egész életen át tartó a 3b ajándékokat: A felnőtt nőstény legyek kevésbé koncentrált étrenden (5% SY) általában lényegesen hosszabb ideig élnek, mint a koncentráltabb étrendben (15% SY).

A kohorszok sűrűsége a fejlődés során befolyásolhatja a felnőttek élettartamát és megváltoztathatja a fejlődés időzítését. Itt bemutatunk egy példát arra, hogy a szinkronizált peték különböző sűrűsége hogyan befolyásolja a lárvák fejlődését. Mint a 4-ben ábrán látható, a felnőtt légy hozama gyenge, és az étel felülete hajlamos a száradásra, ha a tojások száma túl alacsony. A spektrum másik végén a túltelített palackokban késik a lárvák fejlődése, és a felnőtt legyek hozama csökken.

A kohorsz egészének túlélési görbéjét jelentősen befolyásolhatják a rendellenes fiolahatások, mint a 5. ábra Látható. Az egyes injekciós üvegek rendszertelen túlélési adatainak több oka is lehet, például rossz ételminőség vagy baktériumok/gombák felhalmozódása és fertőzése. Bár az ilyen rendellenes halálozások nem torzíthatják a populáció túlélési mértékét, nincs egyszerű mutató arra, hogy megfelelően meghatározzuk, hogy az injekciós üveget ki kell-e zárni a kísérletből. Ezeket a helyzeteket ezért jó kezeléssel lehet elkerülni, és nagy mintanagysággal lehet enyhíteni.

drosophila
1. ábra. A Drosophila élettartam-vizsgálat egyszerűsített sematikus ábrázolása.

2. ábra. (A) Reprezentatív élettartam-görbék w 1118, amelyek a nőstény (körök) és a hím (négyzetek) felnőtteket repítik 25 ° C-on SY10% -os ételen. (B, C) A dLife szoftver reprezentatív képernyőképei.

mérése
3. ábra. A hőmérséklet (A) és a takarmány (B) hatása a felnőtt élettartamára. A. Felnőtt kontroll (Canton S) hím legyeket felnőtt koráig 18 ° C-on, 25 ° C-on vagy 29 ° C-on tartottuk. Felnőtt kontroll (w 1118) nőstény legyeket 15% vagy 5% SY SY diétával etettek.

élettartam
4. ábra. CT-palackokban alikvotákban szinkronizált petesejtek kifejlődésének 9. napja (25 ° C-on). Az embriót tartalmazó alikvot térfogata az egyes palackok alatt látható.

drosophila
5. ábra. A dLife szoftver reprezentatív ábrája az injekciós üveg túlélési arányát mutatja. A nyíl egyetlen injekciós üveget mutat egy csoporton belül.

drosophila
6. ábra. Példák a nem optimális élelmiszerminőségre. A. Hólyagok az élelmiszeripar felületén. B. Az ételek eltávolodtak az injekciós üveg szélétől. C. repedések az ételben. D. Baktériumok felhalmozódása az étel felületén.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Vita

Az itt bemutatott protokoll leírja a felnőttek hosszú élettartamának reprodukálható mérését Drosophilában, amely adaptív a genetikai, farmakológiai és környezeti beavatkozások értékeléséhez. A protokoll központi szempontjai közé tartozik a lárva fejlődési környezetének gondos ellenőrzése, a felnőttek stresszének minimalizálása, valamint a kísérleti csoportok és kontrollok iránti elfogultság minimalizálása. Bemutatjuk a dLife élettartam-kísérletkezelő szoftver használatát is. Azáltal, hogy egyszerűen vonalkódot vagy RFID-címkét csatol minden edényhez, a program segít a dLife adatgyűjtésében az egyes mérésekhez és a túlélési arány görbe ábrázolásához. Bár jelenleg a legmegfelelőbb a légy élettartamának vizsgálatára fiolák segítségével, ez a kísérletkezelő eszköz könnyen adaptálható más organizmusokban, különböző típusú populációs kamrákkal történő felhasználásra, vagy további intézkedésekre, beleértve a stressz-ellenállást és a túlélést Kábítószer-toxicitás.

A lárva/báb környezet szabályozásának fontos szempontjai közé tartozik a túlzsúfoltság elkerülése és az ellenőrzött környezet fenntartása a világos-sötét időszakok, a páratartalom és a hőmérséklet szigorú szabályozásával. Ezek a tényezők mind az időzítés fejlődését, mind az eredményül kapott felnőttek fizikai minőségét befolyásolják. A nemkívánatos lárvakörnyezetek, például a nagy lárvassűrűség, stressz-indukálható tényezők (pl. Hősokk-fehérje expresszió) aktiválódásához vezethetnek, amelyekről ismert, hogy befolyásolják a felnőttek élettartamát 18.

Javasolták az élettartam-elemzés alternatív táplálási megközelítéseit, beleértve a kapilláris adagoló megközelítést (CAFE módszer) 23. Ez a módszer figyelemre méltó az élelmiszer-fogyasztás pontos mérésének képessége miatt, de lényegesen több rövid életű legyet eredményez 24. A táplálkozási környezettel kapcsolatos lehetséges stresszeket fel kell használni az étrend és a genetikai tényezők együttes kapcsolatának értékelése során az általános élettartamban akarat.

A demográfiai elemzés, beleértve a túlélési és a halálozási görbék kiszámítását, sok információt tárhat fel a népesség elöregedésének dinamikájáról. A tipikus túlélési görbe az élet elején hosszabb ideig viszonylag lapos marad, és növeli az idősebb nők csökkenésének ütemét, ami megfelel az alacsony halálozásnak, amelyet a halálozás exponenciális növekedésének időszaka követ. A stresszes környezet általában a lakosság korai halálozásának túllépéseként és a túlélési görbe rendellenes süllyedésében nyilvánul meg. Bár egy ilyen eredmény jelentős különbségeket adhat a kezelések között, általában nem lesz megbízható a replikációra. Ezért azt javasoljuk, hogy legalább két független (azaz nem átmeneti) ismétlési kísérletet hajtsanak végre, mielőtt határozott következtetés vonható le. Szükség lehet további erőfeszítésekre a minta méretének növelésére, a tartási körülmények ellenőrzésére és az anyanövények egészségének javítására.

A stresszes környezeti viszonyok miatt elhunyt állatok jobboldali cenzúráját (az állatok eltávolítását a kísérletből, amelyek vélhetően kiszöknek vagy véletlenszerű okokból elhunytak) rendkívül óvatosan kell alkalmazni. Szigorúan véve a cenzúrának véletlenszerűen kell történnie a kísérleti kezelések során, és ha a kísérleti beavatkozás modulálja a stresszérzékenységet, akkor akaratlanul is kezelési szintű szelekciókat alkalmazhat a populációra. Általános szabály, hogy a korai halált okozó kétértelmű tényezők jelenlétének elkerülése (különösen az élelmiszerforrással összefüggésben) jobb, mint a cenzúrázó eszköz, és a cenzúrázó eszközt csak olyan szervezetekre szabad alkalmazni, amelyekről megfigyelték, hogy fizikai manipuláció közben elpusztulnak vagy megszöknek.

Utolsó szempont a statisztikai szignifikancia értékelése. Míg a nagy kohorszminta nagyságrendek lenyűgöző teljesítményt nyújtanak a kezelések közötti kis különbségek megkülönböztetésében, figyelembe kell venni az ilyen különbség potenciális biológiai jelentőségét is. Meglehetősen nagy élettartam-kísérletek esetén a különbségek statisztikailag nagyon alacsonyak, csupán 2,1%, de a beavatkozás egészségi állapota csekély lehet. Ezért mind a statisztikai, mind a biológiai jelentőséget meg kell adni a kísérlet általános eredményeinek értelmezésében. A túlélési kísérletekből az öregedési folyamatra vonatkozó következtetéseket ki lehet egészíteni az életkorral összefüggő viselkedési vagy fiziológiai egészségügyi intézkedések mérésével, ideértve a mászóképességet 25 és a gyomor-bél falának integritását 7.

Összefoglalva, a Drosophila modell organizmus vonzó választás az öregedés mechanizmusainak tanulmányozásához. Gondos kísérleti technikával a robusztus demográfiai elemzés betekintést nyújthat a farmakológiai és genetikai tényezők öregedési folyamatra gyakorolt ​​hatásaiba.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.