Fehérjetisztító biokémia
A fehérje tisztítása több lépésből álló folyamat: kezdeti extrakció, differenciális kicsapás, dialízis, különféle típusú kromatográfiák stb.
ELMÉLETI ELVEK
A tisztítás fő szakaszai
Jellemzően először azt az anyagot zúzzuk össze, amelyből a fehérjét ki akarjuk vonni (állati szövet, növényrész, baktérium stb.). Különféle eszközök ("Waring Blender", Potter-Eveljhem eszköz, "Polytron" stb.) Használhatók erre a célra. Ez a homogenizálás megfelelő összetételű pufferben történik. Ez a lépés nyilvánvalóan az első.
Ezután különféle technikákat alkalmaznak a kívánt fehérje elválasztására az összes többi fehérjétől. Az első lépések általában nem túl specifikus technikák, de alkalmasak nagy mennyiségek kezelésére. Ezután a lépések folytatásával egyre specifikusabb technikákat alkalmaznak, amelyek gyakran alkalmazhatók csökkentett térfogatú készítményekre.
Az egyik módszer, amely a legmegfelelőbb a nagy mennyiségek számára, az ammónium-szulfát differenciálcsapás. Éppen ezért nagyon gyakran közvetlenül a homogenizálás után használják, hogy megszabaduljon a szennyező anyagok nagy részétől.
A jó mintatérfogatokra alkalmazható, de meglehetősen jó elválasztóerővel rendelkező ioncserélő kromatográfia vagy affinitáskromatográfia jó közbenső módszer.
Végül gyakran alkalmaznak molekuláris szitálást vagy izofókuszálást, amely lehetővé teszi a tisztaság finomítását, de nagyon kis mennyiségű tömény fehérjét igényel.
E lépések között gyakran el kell távolítani az ezekben a kromatográfiákban használt sókat vagy termékeket. Ezután dialízist vagy ultraszűrést alkalmazunk. Ha koncentrálni kell a készítményt, fagyasztva szárítjuk. Ha valaki el akarja kerülni ezeket az eljárásokat, olyan módszereket kell választania, amelyeket nem érintenek hátrányosan ezek a termékek.
Fehérje vizsgálat és fehérje aktivitás vizsgálat
Mindezeket a lépéseket szorosan követni kell annak ellenőrzésére, hogy a technikák jól működnek-e. Ehhez nagyon gyakori a tisztítandó fehérje mérése minden lépés után. Ezért szükséges egy vizsgálati módszer (enzimatikus, immunológiai, biológiai stb.) A folyamat követésére. Megmérjük a fehérje teljes mennyiségét is. Ezt az utolsó értéket kell használni a konkrét aktivitás kiszámításához (lásd a tisztítási táblázatot)
Abban az esetben, ha ez az első alkalom, hogy a fehérjét izolálják, akkor ki kell dolgozni a vizsgálati módszert, mielőtt még a tisztítási módszert is kifejlesztenék.
Tisztítási táblázat és tisztasági kritériumok
Mindezen lépések során elengedhetetlen a két kulcsfontosságú tényező, a tisztaság és a hozam értékelése. A hozam (a kapott fehérje mennyisége) könnyen mérhető enzimatikus vizsgálattal, RIA-val stb. A tisztítási táblázat (lásd a "számítások" szakaszt) szintén nagyon hasznos eszköz erre a célra. Ha valaki úgy találja, hogy a tisztítási lépések egyike a fehérje aktivitásának vagy mennyiségének jelentős csökkenését okozza, akkor megkérdőjelezhetjük annak hasznosságát vagy végrehajtásának minőségét. A specifikus aktivitás a készítmény tisztaságának kvantitatív mértéke. Itt is megint, ha észrevesszük, hogy egy lépés nem teszi lehetővé a tisztaság növekedését, akkor megkérdőjelezzük annak relevanciáját. A hozam és a tisztítás kiszámításához ne felejtsük el megmérni az egyes lépések után kapott frakció teljes térfogatát, és mintákat venni belőle, amelyek lehetővé teszik az összes fehérje és a fehérje mennyiségének meghatározását. próbálja elszigetelni.
A fehérjekészítmény tisztasága minőségi kritériumok szerint is értékelhető. Így nagy felbontású elektroforézissel vagy izoelektromos fókuszálással kvalitatív módon könnyen láthatóvá tehető. Ha csak egy fehérjetsáv látható, akkor arra lehet következtetni, hogy a készítmény csak egy fehérjét tartalmaz. Ez a kvalitatív értékelés azonban torzulhat, ha a fehérjét egy vagy több azonos mozgékonyságú szennyezi az elektroforézis vagy a fókuszálás körülményei között. Ezek a technikák lehetővé teszik a tisztítás követését és annak megállapítását is, hogy a szennyező fehérjék száma csökken-e a folyamat során, ideális esetben egyetlen fehérjefajjal.
MÓDSZERTAN ÉS ESZKÖZÖK
Mindezen lépések során nyilvánvalóan el kell kerülni az izolálni kívánt fehérje denaturálását. Ezért olyan táptalajt kell használni, amelynek jellemzői kompatibilisek a fehérjék stabilitásával (pH, ionerősség, ozmolaritás, sók, antioxidánsok stb.). Ehhez bizonyos, többé-kevésbé „fiziológiás” tápközegeket állítanak elő, például PBS-t vagy sóoldatot, amelyek rendelkeznek néhány ilyen tulajdonsággal. Így a fiziológiás sóoldat (150 mM NaCl vagy 0,85%) szinte fiziológiás ozmolaritása 300 mO. Gyakran puffert használnak a pH fenntartására (általában 7,4 körül). A PBS ("foszfáttal pufferolt fiziológiás sóoldat") foszfátpuffert tartalmaz, amelynek pH-ja 7,4, és összes komponensének ozmolaritása 315 mO. A fiziológiai közegeket a SIITUB "fiziológiai megoldások" szakasza tárgyalja.
A pH megfelelő szinten tartása érdekében az oldatokba általában pufferterméket adnak. A foszfátot (egy- és kétbázisú keverékként) a PBS-ben használják. A triszt (trishidroxi-metil-amino-metánt) alacsony költségei miatt nagyon gyakran használják, még akkor is, ha 7,4-es pH mellett nem túl hatékony, és gátol bizonyos fiziológiai reakciókat. Hepest (hidroxietil-piperazin-etán-szulfát) is gyakran alkalmaznak. A fiziológiás oldatokban a pH puffereléséhez használt fő termékek tulajdonságait és hibáit a SIITUB "pH-mérése" szakasza tárgyalja.
Fontos továbbá elkerülni a fehérjék denaturálását azáltal, hogy levegőnek teszik ki őket vagy habosítják őket, ami denaturációt okoz és elősegíti az oxidációt. Ez különösen érvényes a ciszteinek tiol-funkciójának cisztinná oxidálódására, azaz diszulfid-kötés kialakulására. A citoplazmatikus fehérjék különösen érzékenyek, mivel természetes környezetük, a citoszol enyhén redukálódik. Ezért nem állnak ellen az oxidáló környezeti közegben történő oldódásuknak. E fehérjék védelme érdekében gyakran ajánlott antioxidánsok, például β-merkapto-etanol vagy Cleland egyik reagensének, a ditiotreitol vagy a ditiotreitreol használata. Az extracelluláris rekeszek fehérje (vér, cerebrospinalis folyadék stb.) Sokkal kevésbé érzékeny erre a problémára, mivel enyhén oxidáló közeg. Ezen rekeszek fehérjéi nem tartalmaznak vagy nagyon kevés szabad tiolt tartalmaznak, inkább diszulfidkötéseket tartalmaznak.