Félig nagy áteresztőképességű képalkotó módszer és adatmegjelenítési eszközkészlet a C elemzéséhez

Összegzés

Ez a munka egy félig nagy áteresztőképességű protokollt ír le, amely lehetővé teszi az embriogenezis egyidejű 3D időzített képalkotását 80–100 C. elegans embrióban egyetlen éjszakai futtatás alatt. Képfeldolgozó és vizualizációs eszközök is szerepelnek az adatelemzés optimalizálása érdekében. Ezeknek a módszereknek a testreszabott riporter törzsekkel történő kombinációja lehetővé teszi az embriogenezis részletes nyomon követését.

Absztrakt

Bevezetés

A C. elegans embrió fontos modellrendszer a mechanisztikus sejtbiológia számára, valamint az 1., 2., 3., 4., 5., 6., 7., 8., 9. embrió fejlődését vezérlő sejtsors specifikációjának és morfogenetikus eseményeinek elemzéséhez. A mai napig mind az események sejtszintű jellemzésének, mind az embrióban a sejtek sorsának specifikációinak nagy részét fluoreszcens markerek alkalmazásával viszonylag magas időbeli felbontási kísérletekkel érték el. Míg ez a megközelítés másodpercektől tíz percig terjedő események esetén jól működik, technikailag korlátozottá válik a hosszabb folyamatok óráktól napokig tartó jellemzésére. Az embrionális fejlődés az első hasítástól a nyújtás végéig körülbelül 10 órát vesz igénybe. Ebben az idõszakban azok a féláteresztõ módszerek, amelyek lehetõvé teszik az alacsonyabb idõfelbontású (azaz 5-20 perc idõintervallumban történõ) egyidejû képalkotást a különbözõ körülményekbõl származó nagyobb embriócsoportok számára, új kísérletsorozatot nyitnak meg; z. B. Szisztematikus nagyszabású szűrési erőfeszítések lehetővé tétele és elegendő számú embrió elemzése a molekuláris rendellenességek következményeinek összehasonlításához.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Jegyzőkönyv

1. Készítse elő a C. elegans embriókat a nagy teljesítményű képalkotáshoz

JEGYZET: A protokoll ezen részének célja félig szinkronizált (2–8 sejtes stádiumú) C. elegans embriók populációjának létrehozása, amelyeket megfelelő marker törzsekkel boncolnak (2. ábra) egy üveg alsó 384 lyukú lemezbe képalkotás céljából. Más lemezformátumok is működhetnek, de a 384 mélyedésű lemezeket előnyben részesítjük, mivel a kis kútméret korlátozza az embrió viszonylag kis területre való elterjedését, megkönnyítve ezzel a több embriót tartalmazó mezők azonosítását az időintervallumú képalkotáshoz. Az embriók hozzávetőleges szinkronizálása biztosítja, hogy egy mezőben lévő embriók teljes fejlesztési folyamata fel legyen jegyezve.

2. Embrionális letalitás pontozása

A beolvasott mezők alapján az embrionális letalitást és a lárvák hibáit úgy értékeljük, hogy minden egyes kútnál megszámoljuk a kikelt férgeket és a nem csípett embriókat.
Érje el a nem csípett embriókat, mint embrió halálát. Zárja ki a letartóztatott egy-négy sejtes embriókat a halálozási pontszámból, mivel a fiatal boncolt embriók néha nem tudják befejezni a tojáshéj képződését (ha a meiózis II még nem teljes), és a permeabilitási hibák ozmotikus szövődményekhez vezethetnek az első két évben. Üzleti területek.
Pontszám részben kikelt vagy teljesen kikelt férgek, amelyeknek morfológiája vagy viselkedési rendellenességei vannak, például ürülékenyek vagy megbénultak, mint "rendellenes lárva".

3. Automatizált vágás (3. ábraA.)

JEGYZET: A szoftver két helyen található: (1) Zenodo a 12 szoftver felhasználóbarát verziójával rendelkezik, amely nem igényel programozási ismereteket. (2) Github tartalmazza az embryoCropUI.py és a screenCrop.py 13 szoftverünk forráskódját, amelyekhez a Python ismerete szükséges. Az alábbiakban részletes utasításokat talál a program mindkét verziójának letöltésére és használatára vonatkozóan.

4. Megjelenítés (4. ábra)

JEGYZET: OpenandCombine_embsV2.ijm A 10, 12 egy ImageJ makró, amely könnyen felismerhető tiff fájlt hoz létre az összes képből egy adott szakaszra és feltételre. FIJI/ImageJ 14, 15 telepítése szükséges. Ezt a makrót a fájlszerkezetünknek megfelelően hajtjuk végre. Meg kell változtatni, hogy különböző fájlstruktúrákkal működjön. A megfelelő fájlszerkezetről és a fontos szempontok részletes ismertetéséről a GUI_Instructions_zenodo_repoV2.docx fájl a Zenodo tárházban. Kérjük, olvassa el ezeket az utasításokat, mielőtt megnézné a fájlok megfelelő elnevezését és strukturálását, hogy a makróval a legjobb felületet érje el. Referenciaként a fájl helyszerkezetünk így néz ki:
Z: testreszabott, Tar''Strain'Emb'Target_Emb'_15 számjegyű egyedi azonosító _W '# F_T' #_ Z '#_ C'.tif
pl. Z: -cropped-EMBD0001-GLS-Emb1-EMBD0001_Emb1_20140327T135219_W02F1_T01_Z01_C1.tif

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Reprezentatív eredmények

A molekuláris rendellenességek C. elegans embriófejlődésére gyakorolt hatásának jellemzésében az a fő kihívás, hogy az embrióknak az első hasítástól a 20 ° 16-os nyújtás végéig kb. 10 óráig kell haladniuk. A félig áteresztõ megközelítés, amely lehetõvé teszi az embriók nagy kohorszainak egyszerre történõ leképezését, hasznos az idõskálán történõ eseményekhez, mivel lehetõvé teszi, hogy a kvantitatív elemzés lehetõvé tétele érdekében több feltételt párhuzamosan feltérképezzünk az egyes feltételekhez elegendõ együttes méret mellett (1. ábraA.).

2. ábra A C. elegans embriogenezisének nagy felbontású képalkotásához létrehozott egyedi törzsekvoltak. (A.) A sémák szemléltetik a csírasejt-törzsek (felső) és a morfogenezis (alsó) felépítéséhez használt transzgéneket. (B.) A maximális intenzitású vetítési felületek a morfogenezis (fent) és a csíraréteg (alul) törzsek fejlődési idejét mutatják. A ventrális nézetet a kapcsolási rajzok mutatják (balra). Az idő a tizedesponthoz (t = 0) viszonyul, amely mindkét szárban könnyen azonosítható. Méretarány = 10 m. Ábra Wang és mtsai engedélyével. 10 reprodukálva. A kép nagyobb verziójának megtekintéséhez kattintson ide.

3. ábra Az egyedi vágási program izolálja és irányítja az egyes embriókat a képmezőkből. (A.) A Schematic bemutatja az egyedi embrióvágó program funkcionalitását, és kiemeli a program elérésének két lehetőségét: egy felhasználóbarát GUI felület, amely nem igényel programozási ismereteket és a Zenodo (balra) alapú, valamint a program kötegelt vágási verziója, a Python Tapasztalatot igényel, és elérhető a Github oldalon (jobbra). (B.) A grafikus összefoglalja az automatizált kivágási algoritmust - egy 8 bites fényerejű képekből bináris maszkot hoznak létre, és az egyes embriókat felismerik, kivágják és igazítják az első hátsó tengely mentén. A méretarány 10 m. (C.) Vázlatosan írja le azt az eljárást, amelyet az embriók iteratív felismerésére használnak a bináris maszkban. (D.) Vázlatosan szemlélteti az embriók elülső-hátsó tengelye mentén történő orientálásának módszerét. A B-D panelek Wang és mtsai engedélyével reprodukálhatók. 10. A kép nagyobb verziójának megtekintéséhez kattintson ide.

4. ábra: Az ImageJ egyéni makró lehetővé teszi az RNAi szűrési adatok vizualizálását azáltal, hogy minden feltételhez összetett fájlokat generál. (A.) A 40 gén tesztkészletből származó három példa RNSi-állapot embriói (a teljes adatkészletről lásd Wang és mtsai. 10, 11) (jobbra), kiemelve az egyes közös aláírási fenotípusokat és a reprodukálhatóságot az egyes állapotokon belüli fenotípusok. A panel Wang és munkatársai engedélyével készült. 10 adaptálva. (B.) A központ azt szemlélteti, hogy az egyedi ImageJ makró (OpenandCombine_embsV2.ijm) hogyan építi az embriókat egy adott RNAi feltételből egy összetett ImageJ fájlba, amely az egyes embriókhoz a fénymezőt és a maximális intenzitású vetületeket állítja be az egyes időpontokban. Bár csak egy példát emelünk ki, ez a makró egyszerre számos RNAi-állapotra képes összeállítani az adatokat. Az ImageJ makró elérhető a Zenodo 12-en. Méretarány = 10 m. Kattintson ide az ábra nagyobb változatának megtekintéséhez.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Vita

A félig nagy áteresztőképességű film módszer az itt leírt embrió-vágási és képfeldolgozó eszközökkel együtt megkönnyíti a C. elegans embrionális fejlődésének elemzését különféle mutánsokkal, rendellenességekkel és marker törzsekkel. Saját laboratóriumunkban jelenleg nagyszabású szűrés zajlik, amely ezeket a módszereket alkalmazza az itt leírt két egyedi test törzséből származó embriók filmezésére, miután 2000 gén kifejlődése kellett hozzá. Végül ezekből az erőfeszítésekből származó adatok további erőforrásként szolgálnak a sejtek sorsának és az embriogenezis során bekövetkező morfogenetikus események specifikációjának megértésére irányuló erőfeszítések fokozására.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.