Felnőtt zebrafish orális intubálása A bioaktív vegyületek intesztinális felhasználásának értékelésére szolgáló modell

Összegzés

A protokoll leírja a felnőttkori zebrafish-szondák biológiai vizsgálatát; majd boncoljuk és készítsük el a citometriát, a konfokális mikroszkópiát és a qPCR bélet. Ez a módszer lehetővé teszi a bioaktív anyagok kezelését a bélfelvétel és a kiváltott helyi immun inger figyelemmel kísérésére. Fontos az orális profilaxis béldinamikájának vizsgálata.

Absztrakt

Bevezetés

Biomedicina kontextusban érdekes a vegyületek biológiai hatásainak tesztelésére kifejlesztett modell orális intubáció után. A bél sok anatómiai és fiziológiai jellemzője konzerválódott a bilateriai vonalak között emlősökkel és csontos halakkal 11. Ez a downstream analízishez kapcsolt orális intubációs modell eszköz lehet az emberi biológia betekintésére, valamint a biológia vagy más anyagok vizsgálati terepe in vivo.

Az orális intubációs protokollt egy operátor hajthatja végre, például sikeresen beadva akár 50 ul 1 g tömegű fehérje nanorészecske szuszpenziót is, magas halászati túlélési arány mellett. A folyamat könnyen beállítható és gyors; 30 óra intubálható 1 óra alatt. A bélkészítés protokollja kulcsfontosságú a sejtminták biztosításához és a későbbi elemzéshez. A downstream eredményekre vonatkozó példák, amelyek bemutatják a protokoll alkalmazását a qPCR izolátum bélfelvételére és minőségi RNS -ére vonatkozó adatok megszerzésében. A protokoll nagyon hasznos lenne azok számára, akiknek megfelelő modelljük van az orális profilaxis vagy más vegyületek dinamikájának tesztelésére a bélben.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Jegyzőkönyv

Valamennyi kísérleti eljárást a zebrafish (Danio Rerio) engedélyezte az Universitat Autònoma de Barcelona (CEEH 1582 sz.) Etikai bizottságának az állatok kutatásának nemzetközi irányelveivel összhangban (. EU 2010/63). Az összes élő zebrafishal végzett kísérletet 26-28 ° C-on végeztük.

1. Készítse elő az orális intubációhoz szükséges felszerelést

Helyezzen kb. 1 cm finom szilikoncsövet egy 31 G-os Luer zár tűre, hogy ellepje a tű hegyét.
Vágjon ki egy 10 µL steril szűrőpipetta hegyet (kb. 2 cm), vegye a finomabb végét, és fedélként helyezze a szilikon csőre. Ügyeljen arra, hogy a tű hegye kilógjon a pipettából, hogy ne sértse meg az állatot.
Helyezze a tűt egy 100 µL Luer Lock fecskendőre.
MEGJEGYZÉS: Öblítse le etanollal, majd foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS, lásd anyagok) alaposan a kezelések között.

(2) a szükséges megoldásokat

Készítsen 150 mg/l (érzéstelenítéshez) vagy 300 mg/l (eutanáziához) etil-3-amino-benzoát-metánszulfonát (MS-222) oldatot vízzel az akváriumból, ahol a zebrafish-t ápolják. Töltsön meg egy kis edényt 1 liter érzéstelenítő oldattal, és szellőztesse.
Töltsön meg egy másik kis tartályt 1 liter akváriumvízzel, az MS-222 hal helyreállítása nélkül, és tartsa levegőn.
Készítsen 50 ml 1x PBS-t 10x steril törzsoldatból.
Citometriás analízis/izolált bélsejtek Készítsen elegendő mennyiségű friss 0,15% -os IV típusú kollagenáz oldatot halanként 1 ml-re törzsoldatból vagy porból Dulbecco Modified Eagle táptalajában (DMEM) 1% V/V penicillinnel és sztreptomicinnel (lásd az anyagot). Készítsen 1 ml-es alikvotákat (1 halanként) 2 ml-es centrifuga csövekben. A boncolás előtt tartsa a tempót 4 ° C-on 30 percig.
A konfokális mikroszkóp/minta rögzítéséhez készítsen elő 50 ml friss, 4% -os paraformaldehid (PFA) oldatot PBS pufferrel, vagy felolvasztja a törzsoldatot egy -20 ° C-os fagyasztóban, párakamrában.
Figyelem: A PFA mérgező. Kérjük, olvassa el a biztonsági adatlapot, mielőtt vele dolgozik. Kesztyűt és védőszemüveget kell viselni, és mindig hagyjon megoldásokat a páraelszívóban.

3. A fluoreszcens nanorészecske szuszpenzió előállítása

4. Zebrafish érzéstelenítés és orális intubáció

5. Zebrafish bél boncolás

7. Készítse elő a bél kriosekcióit a konfokális mikroszkópiához

8. A belek előkészítése a valós idejű qPCR (RT-qPCR) számára

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Reprezentatív eredmények

A kevert nemű zebrafish-t (átlagos súly: 1,03 ± 0,16 g) sikeresen intubáltuk különböző rekombináns fehérje nanorészecskékkel (baktérium zárványtestek) házi készítésű orális intubációs eszközünkkel (1. ábra)). Sikeresen elvégeztük az orális intubációt és alacsony átlagos mortalitási százalékot (6,8%) értünk el (Asztal 1). A zebrafish-t 30 µl vagy 50 µl nanorészecske-szuszpenzióval intubáltuk, és az intubációt követő 24 órán belüli mortalitást kiszámítottuk. A kísérleteket két operátor hajtotta végre, R-nek kevesebb tapasztalata volt a zebrafish orális intubáció kezelésében, mint J. Az eredmények azt mutatták, hogy még egy új operátor is képes önállóan elvégezni az orális intubációs kísérletet, és könnyen elérheti a magas túlélési arányt ezen a protokollon keresztül. Tapasztalataink szerint az optimális halméret 1 g, de sikeresen intubáltuk a 0,5 g-os halakat is.

Annak érdekében, hogy jobban megértsük, hogy a fluoreszcens nanorészecskék IBs TNF einje (rekombináns citokin fehérje, amely nanoszerkezetű, mint zárványtestek) zebrafish-t áthaladnak-e módszerünkkel és felszívják-e a zebrafish bélben, vagy sem, elvégeztük a citometriás elemzést. A nanorészecskéket (100 ng/hal, 50 ui) és a PBS-t (kontroll) orálisan adtuk be a zebrafish-nak (intubációval), és a beleket 5 és 24 órával az intubálás után boncoltuk. Az összes bélsejtet előállítottuk a 6. lépésből, és a fluoreszcencia emissziós jel detektálásával elemeztük. A fluoreszcencia intenzitás reprezentatív hisztogramjait és a fluoreszcens sejtszázalék ponttáblázatait a 2. ábra mutatjaLátható. A fluoreszcens sejtek sűrűsége szignifikánsan nagyobb a nanorészecskékkel intubált csoportban a kontroll csoporthoz képest 5 és 24 óra alatt (2. ábraA.). A fluoreszcens sejtek százalékos aránya szignifikánsan magasabb a nanorészecske intubált csoportok 5 órájában (46,3%) és 24 órájában (43,0%) (2. ábraB.).

A bélrétegnek a nanorészecskék felvételében részt vevő részének további vizsgálatához konfokális mikroszkópos elemzést végeztünk. A nanorészecskéket (20 µg/hal, 50 µl) és a PBS-t (kontroll) orálisan intubáltuk zebrafish-on, és a beleket az intubáció után 5 órával boncoltuk. A bélszakaszokat fagyasztott szöveti eljárással a 7. lépés után(3. ábra)előkészített. A bélben lévő fluoreszcens nanorészecskék konfokális képeit a 3. ábra mutatjaB.Látható. A fluoreszcens nanorészecskéket a zebrafish belekben találtuk. Megfigyeltük a fluoreszcenciát a hámsejtekben, a lamina propria és az izomsejtekben.

Annak ellenőrzésére, hogy a protokollunk révén kiváló minőségű RNS-t tudunk-e kinyerni, elemeztük a belekből kivont RNS-t egy bioanalizátor segítségével (amelyet itt RNS-analizátornak is nevezünk). A zebrafish-t orálisan PBS-sel (50 ul) vagy a nanorészecskékkel (20 ug/hal, 50 ul) intubáltuk. A beleket RNS-extrakcióra boncoltuk az intubáció után 24 órával. Hét RNS mintánk van, amelyeket az analizátorral tesztelhetünk. Megállapítottuk, hogy az összes vizsgált RNS-minta magas RNS-integritási számmal rendelkezett, 7,9 és 8,9 között (4. ábra)).

1. ábra : Orális intubációs eszköz. (A.) 31 G-os Luer Lock tű képe egy 100 µL-es fecskendőn, a szilikoncsővel és a pipetta hegyével a tű hegyére rögzítve. (B.) a tűrész nagyított képe. A fekete nyíl azt jelzi, hogy a pipetta hegye meghaladja a tű hegyének végét. Kattintson ide az ábra nagyobb változatának megtekintéséhez.

4. ábra : Az RNS-analizátor virtuális gélképén 7 zebrafish belekből kivont RNS-t mutatunk, amelyekből az intubáció után mintát vettünk. Az 1. és 2. minta a PBS intubált csoportja, a 3–7. Minta nanorészecske intubált csoport. Az RNS integritási számok (RIN) alul vannak megadva 7,9 és 8,9 között. Kattintson ide az ábra nagyobb változatának megtekintéséhez.

operátor	hangerő	# Hal intubált	Közepes súlyú (g ± SD)	# Halálozások	Halandóság (%)
R.	30 ΜL	22-én	0,88 ± 0,14	3	13.6
R.	30 ΜL	17-én	0,93 ± 0,19	0	0
J	50 ΜL	19-én	1,23 ± 0,31	1	5.2
J	50 ΜL	30-án	1,08 ± 0,40	2	6.6
Összességében	88	1,03 ± 0,16	6.	6.8
SD: az átlag szórása

Asztal 1: A protokoll segítségével két operátor által okozott zebrafish mortalitás összehasonlítása. Megjelenik a kezelő azonosító kódja, az intubált térfogat, a halak száma és a hal tömege grammban (g).

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Vita

Ez a protokoll a Collymore és munkatársai által korábban leírt orális intubációs technika fejlesztése. A protokollunk 4. része részletesen leírja az orális intubációs módszert, és tartalmazza a bél előkészítését a későbbi elemzéshez. Módszerünk javítja a halak manipulálásának sebességét, így egy személy gyorsan és a kezelőn belüli nagy eltérések nélkül tudja végrehajtani a teljes protokollt. Jelentős különbség az előzőhöz viszonyított protokollunkhoz képest, hogy az orális intubációs kísérlet sikerességét nemcsak az állat jólétének (pl. Vérzés nélküli) és a beadott folyadék szivárgásának megfigyelésével, hanem a bevitel ellenőrzésével is értékeljük. a bélben lévő bioaktív nanorészecskék vizsgálata utólagos elemzéssel (citometria, konfokális mikroszkópia és qPCR). Megmutattuk, hogy intubált penetránsokat jelöltek nanorészecskék a bélben.

Vizsgálatunk korlátai a hal nagysága, mivel nem teszteltük 0,5 g-nál kisebb halak beadását és kémiai érzéstelenítő alkalmazását az állatok megnyugtatására. Egyes szerzők hideg vizet (0-4 ° C) használnak a zebrafish érzéstelenítésére, de állatjóléti és európai jogi szempontból úgy döntöttünk, hogy az MS-222 lesz a választott módszer.

A zebrafish sok előnyt kínál más modellrendszerekkel szemben, ideértve a genetikai adatok teljes készletét és a rendelkezésre álló transzgénikus vonalakat. Immunológusok számára a transzgénikus vonalak (pl. SF Mpx: GFP és Tg Mpeg1: GFP) színteret biztosítanak az immunsejtek, például a makrofágok és a neutrofilek in vivo megfigyeléséhez 19, 20. Az orális intubáció és a downstream elemzés transzgenikus vonalakkal való kombinálása ideális lenne a halakban lévő orális vakcinák, nanorészecskék és kórokozók felvételében, transzportjában és feldolgozásában részt vevő sejtek azonosításához.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Közzétételek

A szerzők kijelentik, hogy nincs összeférhetetlenség.

Köszönetnyilvánítás

Ezt a munkát a spanyol Tudományos Minisztérium, az Európai Bizottság és az AGAUR támogatásai támogatták az NR számára (AGL2015-65129-R MINECO/FEDER és 2014SGR-345 AGAUR). Az RT elődoktori pályázatot kapott az AGAUR-tól (Spanyolország), JJ-t a China Scholarship Council (Kína) doktori támogatása támogatta, az NR pedig a Ramón y Cajal programon alapul (RYC-2010-06210, 2010, MINECO). Köszönjük Dr. Torrealba a fehérjetermeléssel kapcsolatos tanácsért, N. Barba a "Servei de Microscopia" -tól és Dr. M. Costa, az Universitat Autònoma de Barcelona "Servei de Citometria" -ja a hasznos technikai támogatásért.