Frissen izolált emberi detrusor sima izomsejtek előállítása és felhasználása
Összegzés
Leírunk egy eljárást frissen izolált detrusor sima sejtek előállítására emberi vizelettartály mintákból, kétlépcsős enzimatikus eljárással. A kapott életképes DSM-sejtek különféle egysejtű technikákkal tanulmányozhatók, ideértve az amfotericin-B tapaszbilincs-elektrofiziológiát, amely fiziológiai és farmakológiai tulajdonságok feltárására szolgál.
Absztrakt
Bevezetés
Az 1980-as évek végén és az 1990-es évek elején az Isenberg-csoport (Németország) elektrofiziológiai vizsgálatok sorozatát tette közzé tengerimalac vizelet hólyagjaiból nyert frissen izolált DSM-sejtekről (táblázat, 9., 10., 11., 12., 13.)1). A módszer két fontos megfigyelést emelt ki, amelyek elősegítették a létfontosságú sejtek biztonságát, és kiinduló útmutatásként szolgáltak mások követésére. 1) az izolált DSM darabokat Ca2-mentes/tápközeg oldattal előkezelték az enzimkezelés előtt, és 2) a szöveteket emésztették kollagént tartalmazó oldattal. Ezt a két kritikus lépést beépítették a DSM sejtdiszociációs eljárások minden későbbi variációjába (Asztal 1). Jelenleg csoportunk szekvenciális kétlépcsős papain-kollagenáz disszociációs megközelítést alkalmaz. A DSM darabjait először papaint tartalmazó enzimatikus oldattal, majd ugyanabban az oldatban oldott II típusú kollagénnel kezeljük (DS, boncolási/emésztési oldat). Ez a megközelítés egyedi DSM-sejteket eredményez különféle fajokból, beleértve a tengerimalacot, a sertést, a patkányt, az egeret és különösen az embert (Asztal 1).
Összességében az itt leírt módszer az emberi húgyhólyagból frissen izolált egyetlen DSM-sejt előállítására életképes sejteket biztosít, amelyek nagyon alkalmasak elektrofiziológiai vizsgálatokhoz a tapaszbilincs technika, a Ca2-képalkotás, az immunocitokémia, a vizsgálat különböző konfigurációinak alkalmazásával a proximális in situ peres eljárásokhoz. és egysejtű RT-PCR/qRT-PCR, valamint fejlett molekuláris biológiai technikák, beleértve a mikroarray, az RNS-seq és a CHIP-seq elemzést. Az amfotericin-B perforált patch clamp módszer használata megőrzi a natív sejtes környezetet, ellentétben más konfigurációkkal. Ha az itt leírt, a K és Ca 2 áram DSM-cellákba történő bejuttatásának megszakítására tervezett specifikus feltételeket alkalmazzák, a feszültség által indukált áramok a nem szelektív kationok biofizikai jellemzésre alkalmas tulajdonságait és farmakológiai.
Jegyzőkönyv
Az itt leírt összes módszert jóváhagyta a Tennessee Egyetem Egészségtudományi Központjának (Memphis, TN, IRBMD 17-05714-XP) és a Dél-Karolinai Orvostudományi Egyetem (Charleston, SC, IRBMD 00045232). A jóváhagyott eljárások lehetővé teszik a teljes vastagságú (1 cm x 1 cm-es) húgyhólyagminták összegyűjtését a páciensektől, beleértve a nyálkahártyát, a detrusor simaizomot és a serosát is az erekhez és a zsírszövethez) - műtéti részleges hólyag eltávolításon áteső donorok. A donoros betegek felnőttek (eddig vizsgált korcsoport: 25–87 év), férfiak vagy nők, túlműködő hólyag tüneteivel vagy anélkül (az American Urological Association I-PSS pontszáma 41). A műtéti eljárások különféle egészségügyi állapotokat foglalnak magukban, ideértve az urothelialis carcinoma radikális cystectomia-ját és az adenocarcinoma-t is. Ilyen esetekben az összegyűjtött vizelettartály mintát eltávolítják a tumor helyéről.
1. A DSM szövetének boncolása és DSM darabok előkészítése nyálkahártya nélkül
2. A DSM darabjainak enzimatikus disszociációja, amely frissen izolált DSM egyetlen sejteket eredményez
3. A DSM-cellák feszültséglépcsője által indukált kationáramok rögzítése az amfotericin-B perforált teljes cellafeszültség-korrekciós technikával
4. Adatok elemzése és vizualizáció