Humán metapneumovírus (hmpv) genom-kimutatása kórházi gyermekeknél - ingyenes PDF
Humán metapneumovírus (hmpv) genom-kimutatása kórházi gyermekeknél Első értekezés a Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Felső Orvostudományi Karának doktori fokozatának megszerzéséhez Thomas Bernd Glatzel Bonnból, 2008
Készült a Bonni Egyetem Orvostudományi Karának jóváhagyásával 1. Lektor: Dipl.-Biol. Priv.-Doz. Dr. rer. nat. Oliver Schildgen 2. bíráló: Prof. Dr. med. Jürgen Rockstroh szóbeli vizsga napja: 2008. október 27. A Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonni Orvosi Mikrobiológiai, Immunológiai és Parazitológiai Intézet igazgatója: Prof. Dr. med. Achim Hörauf Publikáció: Ez a disszertáció elektronikusan jelenik meg az ULB egyetemi publikációs szerverén: http://hss.ulb.uni-bonn.de/diss_online.
Tartalom 0 Rövidítések listája 7 1 Bevezetés 9 1.1 Paramyxovírusok 9 1.1.1 Besorolás 10 1.1.2 Szerkezet 12 1.1.2.1 Vírusrészecskék 12 1.1.2.2 Genom és genomszerkezet 12 1.1.2.3 Vírusproteinek 14 1.1.3 Replikáció 16 1.1.4 Parainfluenza vírusok 17 1.1.5 Mumpsz vírus 19 1.1.6 Kanyaró vírus 20 1.1.7 Légzőszervi syncytialis vírus (RSV) 23 1.1.8 Humán metapneumovírus (hmpv) 25 1.2 A munka célja 29 2 Anyag és módszerek 30 2.1 Anyag 30 2.1.1 Berendezések 30 2.1.2 Vegyszerek 31 2.1 .3 Táptalaj 32 2.1.4 Sejtkultúrák 33 2.1.5 Törzsoldatok 33 2.1.6 Pufferek 34 2.1.7 Gyors tesztek 34 2.1.8 Reagens rendszerek 35 2.1.9 Enzimek 35 2.1.10 Nukleotidok 35 2.1.11 Primerek 35 2.1.12 DNS-mércés 36 5
2.1.13 Plazmák 36 2.1.14 Minták 36 2.2 Módszerek 37 2.2.1 Sejtkultúra 37 2.2.2 RNS extrakció sejttenyészet felülúszójából az RNeasy Protect Mini Kit alkalmazásával 38 2.2.3 Polimeráz láncreakció (PCR) 40 2.2.4 Gélelektroforézis 45 2.2.5 PCR-amplifikációk QIAquick-PCR tisztító készlet segítségével 46 2.2.6 A PCR-amplifikátumok klónozása TOPO TA klónozó készlet segítségével 47 2.2.7 Rekombináns plazmidok szekvenálása 50 3 Eredmények 52 3.1 RNS-későbbi puffer 52 3.2 Sejtkultúra 53 3.3 A PCR optimalizálása 53 3.4 hmpv és RSV fertőzések 54 3.5 Életkor szerinti megoszlás 55 3.6 Szezonális lefutás 56 3.7 Tünetek és diagnózis 57 3.8 Koinfekciók 57 3.9 Esetek 58 3.10 Hmpv és otitis media 65 4 Megbeszélés 67 5 Összefoglalás 71 6 Bibliográfia 72 7 Köszönetnyilvánítás 88 6
0 Rövidítések listája: APV madár-pneumovírus CMV CPE CRP CT citomegália vírus citopátiás hatás C-reaktív fehérje Számított tomogram DNS dntps Deoxiribonukleinsav Dezoxiribonukleozid-trifoszfátok E. coli Escherichia coli EDTA Etilén-diamin-tetraecetsav EEG-enzim. és egyéb FCS magzati borjúszérum GCS Glasgow kómás skála HBV HCV HHV hmpv HSV Hepatitis B vírus Hepatitis C vírus Emberi herpesz vírus Emberi metapneumovírus herpes simplex vírus kb kd Kilobázisok Kilodalton 7
LB mm mrna MRT Luria-Bertani Millimolar messenger-ribonukleinsav Mágneses rezonancia tomogram ND nm NS nem végzett Nanométer Nem strukturális fehérje PBS PCR Foszfáttal pufferolt fiziológiás sóoldat Polimeráz láncreakció SDS SSPE Nátrium-dodecil-szulfát Szubakut szklerotizáló panencephalitis RNS rpm vírus RSVascularis µg perc Vascular µg
A paramixovírusokat a következő öt tulajdonság jellemzi: 1. Negatívan orientált egyszálú RNS-sel rendelkeznek, amely kizárólag egy RNS-rezisztens, spirális nukleokapszidban található meg, amely a virális polimerázt is tartalmazza. 2. Az átírást tipikus stop-restart módban hajtjuk végre. 3. A vírusreplikáció a citoplazmában megy végbe. 4. A vírusrészecskék lipid burkolatot igényelnek a célsejteken ahhoz, hogy megkötődjenek. 5. A vírus behatol a sejtbe a vírusmembrán és a sejtmembrán fúziója révén (Collins és mtsai., 2001) 1.1.1 Osztályozás A paramyxovírusokat két alcsaládba sorolják: a paramyxo- és a pneumovirinae. A nemzetségekre és néhány jellegzetes képviselőre történő további felosztást az 1. táblázat mutatja. 10
Alcsalád nemzetségbe tartozó emberi állatok Paramyxovirinae Respirovirus 1. és 3. típusú szarvasmarhák 3. típusú parainfluenza vírus, Sendaivirus Rubulavirus mumpsz vírus, 2. és 4. típusú parainfluenza vírus, 2. típusú kutya parainfluenza vírus, Avulavirus Newcastle vírus, vírus Newcastle vírus vírus Kérődzők-vírus Henipavirus Hendravirus Nipahvirus Hendra Nipah Menangle Pneumovirinae Pneumovirus Respiratorikus szarvasmarha Syncytialis vírus (RS- Respirációs vírus) Syncytialvírus, az egér Pneumonia vírusa Metapneumovírus Humán Rhinotrachrétisz vírus a Nemzetközi Vírusrendszertani Bizottság 2000-ben 11
2 Anyag és módszerek 2.1 Anyag 2.1.1 Inkubátor berendezés: CO 2 -gázos inkubátor, Heraeus, Hanau C200 inkubátor, Labotect, Meckenheim elektroforézis kamrák: B1 modell, PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen 41-1825 modell, PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen Schüttler: Certomat S, Sartorius BBI Systems International GmbH lengő platform, Biometra GmbH, Göttingen Sequencer: 3130 genetikai elemző, alkalmazott bioszisztémák, Darmstadt feszültségű készülékek: 500/200. Tápegység, Bio-Rad Laboratories, müncheni tápegység 250/2.5, Bio-Rad Laboratories, München Steril padok: Herasafe, Heraeus Instruments, Hanau STERIL-ANTARES, Biohit Deutschland GmbH, Rosbach Thermocycler: Mastercycler gradiens, Eppendorf, Hamburg T3 Thermocycler, Biometra GmbH, Göttingen Vortexer: Vortex-Geniea, Fisher: PM 1200, Mettler Toldedo GmbH, Svájc Vízfürdő: GFL 1038, Gesellschaft für Labortechnik mbh, Burgwedel Centrifugák: Biofuge 13, Heraeus Instruments, Hanau Cent rifuge 5415 C/5417 C, Eppendorf AG, Hamburg Megafuge 1.0, Heraeus Instruments, Hanau MULTIFUGE L-R, Heraeus Instruments, Hanau TDX Centrifuge TM, Abbott Diagnostica, Wiesbaden UJ II KS, Heraeus Instruments, Hanau 30
2.1.2 Vegyszerek A vegyszereket használó vállalatok a következők: Agarose Ampuwa Bacto-Agar Bacto-Tryptone Bacto élesztő kivonat Bórsav Bromofenol Kék Sas s-minimális nélkülözhetetlen Közepes EDTA Etanol Etidium-bromid Magzati borjúszérum Kálium-klorid Kálium-hidrogén-foszfát Nátrium-klorid-dinátrium-hidrogén-foszfát Tripszin/EDTA oldat SeaPlaque GTG Agarose, Cambrex Bio Science Rockland, Inc.; Biozym Seakem LE Agarose, Biozym, Oldendorf NuSieve GTG Agarose, Biozym, Oldendorf Fresenius Kabi, Bad Homburg Difco, Detroit, USA Difco, Detroit, USA Difco, Detroit, Amerikai Egyesült Államok Merck KGaA, Darmstadt Serva, Heidelberg D Merckst KA KGaA Darmstadt Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim Biochrom, Berlin Merck KGaA, Darmstadt Merck KGaA, Darmstadt Merck KGaA, Darmstadt Merck KGaA, Darmstadt Merck KGaA, Darmstadt Biochrom AG, Berlin 31
2.1.3 Média Eagle s Minimal Essential Medium Eagle s-mem-earle NaHCO 3: Glutamin Penicillin G Streptomycin Magzati borjúszérum Biochrom AG, Berlin 2,2 g/l 280 µg/l 40 U/ml 50 µg/l 10% (v/v) Luria Bertani táptalaj (LB táptalaj) ampicillin Bacto élesztő kivonattal 2,5 g Bacto-Tryptone 5 g NaCl 2,5 g Aqua dest. 500 ml-en Ezt az elegyet 20 percig autoklávban tartjuk, hűtőszekrényben 4 ° C-on tároljuk, és az oltás előtt 50 μg ampicillint adunk hozzá. Luria Bertani agarlemezek (LB agarlemezek) ampicillinnel Bacto élesztő kivonat 2,5 g Bacto tripton 5 g NaCl 2,5 g Bacto agar 6,25 g desztillált víz. 500 ml-en Ezt az elegyet 20 percig autoklávban tartjuk, miután a tápközeg lehűlt, hozzáadtunk 50 ug ampicillint, és mindegyikből 20-30 ml-t egy Petri-csészébe (Ø: 10 cm) tettünk, majd ezt 4 ° C-on hűtőszekrényben tároltuk. 32
SOC táptalaj (6 ml) tripton 2% élesztő kivonat 0,5% NaCl 10 mm KCl 2,5 mm MgCl 2 10 mm MgSO 4 10 mm glükóz 20 mm 2.1.4 Sejtkultúrák Vero-B4 sejtek ATCC-ACC-33 LLC -MK2 sejtek ATCC-CCL7 MS sejtek, amelyek nem szerepelnek az ATCC listában MDCK sejtek ATCC-CLL-34 RD sejtek A-204; ATCC-ACC-250 2.1.5 törzsoldatok Ampicillin 50 mg/ml (H 2 O) EDTA (0,5 M) EDTA Aqua dest. nátrium-hidroxid-oldattal pH 8-ra titrálva, autoklávban 186,1 g és 1000 ml etidium-bromid 10 mg/ml 33
Foszfáttal pufferolt sóoldat (PBS) NaCl KCl Na 2 HPO 4 KH 2 PO 4 Aqua dest. A pH-t HCl-re 7,4-re titráljuk, autoklávban 8 g 0,2 g 1,44 g 0,24 g 1000 ml adagonként 2,1,6 puffer Trisz-borát-EDTA puffer (5x TBE puffer) Trisz-bázis bórsav EDTA ( 0,5 M) H 2 O 54 g 27,5 g 20 ml ad 1000 ml 2.1.7 Gyors tesztek RSV gyorsteszt Influenza gyorsteszt RSV tesztkészlet, Directigen, Sparks USA Flu A + B tesztkészlet, Directigen, Sparks USA Ezeknek a gyorsteszteknek az alkalmazása minden felső és alsó légúti fertőzésben szenvedő betegtől kapott mintát influenzára és RSV-re tesztelték. Ezeknek a teszteknek az eredményeit beépítettük e munka eredményrészébe. 34
8 Reagens Systems BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit Applied Biosystems, Foster City USA Expand High Fidelity PCR System Roche Diagnostics GmbH, Mannheim HiSpeed Midi Qiagen GmbH, Hilden, HiSpeed Maxi Qiagen GmbH, Hilden, Németország One Step RT-PCR Kit Qiagen GmbH, Hilden, Németország QIAprep Spin Miniprep Qiagen GmbH, Hilden, Németország QIAquick-PCR-tisztító készlet Qiagen GmbH, Hilden, Németország RNeasy Protect Mini Kit Qiagen GmbH, Hilden, Németország Topo-TA klónozó készlet Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Németország 2.1.9 Enzim-restrikciós enzimek EcoR1 Biolabs, Schwalbach, Németország DNS-polimeráz Thermus aquaticus DNS-polimeráz Roche Applied Science, Mannheim, Németország Thermus aquaticus DNS-polimeráz Qiagen GmbH, Hilden, Németország Reverse transcriptase Omniscript, Sensiskript Reverse transcriptase Qiagen GmbH, Hilden, Németország 2.1.10 Nukleotidok dezoxi-adenozin-trifoszfát ( 25 nm) dezoxi-timidin-trifoszfát (25 nm) dezoxi-citozin-trifoszfát (25 nm) deoxiguanozin kioldódás foszfát (25 nm) Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Németország 2.1.11. Láncindítók A négy láncindítót Viazov és munkatársai publikációján alapozták. (2003) készült. Szekvenciáik tehát megfelelnek az N-gén egy régiójának. 35
A munkához használt összes alapozót a Sigma, Deisenhoven gyártotta. A most következő szekvenciákat az 5 3 irányban jegyezzük fel. 111s AGAGTCTCAGTACACAAATMAAAAGAG 705as TGCTTTGCTGCCTGTAGATGATGAG 114s AGAGTCTCAGTACACAATMAAAAGRGATG 442as GCCATTGTTTTYCTTGCYTC 2.1.12 DNS hosszúságú standard 1Kb Plus DNS-Marker, Mannheim, Mannheim a bonni egyetemi gyermekkórház 2001. október 1. és 2004. március 31. között 2001. október 1., 2002. szeptember 30. n = 5 (nem szerepel a tanulmányban) 2002. október 1., 2003. március 31. n = 300, 2003. október 1., 2004. március 31. n = 332 n összesen = 632 36
Célszekvencia 1. Szálak szétválasztása 95 ° C-ra hevítéssel 2. Hibridizáció a primerekkel 54 ° C-ra hűtéssel 3. DNS-szintézis a primerek meghosszabbításával 72 ° C-on 2. ábra PCR-ciklus A kettős spirál 95 ° C-ra melegítve megolvadt a két szálban. A DNS-szintézis megkezdéséhez a célszekvenciával komplementer primereknek először kapcsolódniuk kell. Erre akkor kerül sor, amikor a reakcióelegyet 54 ° C-ra hűtjük. Ezután a primerekből kiindulva a DNS-polimeráz szintetizálja a komplementer szálakat a kiindulási DNS egyes szálaihoz. Ez a reakció lépés 72 ° C-on zajlik. Ezeket a lépéseket többször megismételjük, és a DNS mennyisége exponenciálisan növekszik. 41
Beágyazott PCR A beágyazott PCR egy klasszikus PCR-t követ. Miután a cél DNS-t tartalmazó nagyobb DNS-szakasz replikálódott, ezt a részt templátként használják a beágyazott PCR-hez, amelyben egy kisebb szakasz, amely a cél DNS-t is tartalmazza, replikálódik (lásd a 3.2. Ábrát). Ez az eljárás lehetővé teszi a PCR érzékenységének és specifitásának növelését. Ebben a munkában a Roche Expand High Fidelity PCR rendszert használták a beágyazott PCR-hez. Első kör primer Cél DNS Első kör primer Második kör primer Első transzkriptum Második kör primer A cél DNS specifikus amplifikációja 3. ábra Beágyazott PCR Az ábra felső szakaszában egy PCR látható (lásd fent). A második szakasz a tényleges beágyazott PCR-t mutatja. A második kör láncindítókkal jelölt primerek a beágyazott PCR-ek. Közelebb vannak a cél DNS-hez, mint az első körös primerek. A specifikus DNS-szegmenseket itt is amplifikáljuk a PCR-re fent leírt reakciólépésekkel. 42
52 C 30 mp hőkezelés 72 C 1 perc megnyúlás Ezeknek a ciklusoknak a vége után végső megnyúlás volt 72 C-on 5 percig. A folyamat befejezése után az adagokat 4 ° C-on tároltuk a további felhasználásig. A beágyazott PCR reakció megközelítése hmpv esetén A beágyazott PCR-hez a Roche, Mannheim cégből származó Expand High Fidelity PCR rendszert használtuk. 10-szeres PCR-puffer 5 µl dntps (100 mm) 3 µl enzimkeverék 1 µl 114s primer (25 pmol/µl) 0,5 µl 442as primer (25 pmol/µl) 0,5 µl MgCl 2 (25 mm) 1 µl RNS-mentes víz 34 µl templát 5 µl 50 µl protokoll a beágyazott PCR-t követően 2 percig tartó 94 ° C-os kezdeti denaturálás után 40-szer a következő ciklust hajtottuk végre: 94 ° C 30 sec denaturálás 53 ° 30 sec hőkezelés 72 ° 45 sec megnyúlás Ezt követte egy másik terminál Nyújtás 72 ° C-on 5 percig és tárolás mind a ciklerben, mind a hűtőszekrényben 4 ° C-on. Hígítási sorozatok a beágyazott PCR optimalizálására magnézium hozzáadásával ellentétben Viazov és mtsai. (2003) által javasolt PCR-protokollt, ebben a munkában a beágyazott PCR-hez magnéziumot adtak a stabilizáláshoz. 44.
35,00% 30,00% 25,00% 20,00% 15,00% 10,00% 5,00% 0,00% 30,40% 26,70% 28,60% 22% 18% 13. 70% 4,30% 3,60% 3,95% 2002/2003-as évad 2003/2004-es évad Összesen hmpv RSV hmpv + rsv 6. táblázat Az RSV és hmpv vagy kettős fertőzések százalékos aránya a 2002.10.01-től 31.03-ig terjedő időszakokban. 2003 (2002/2003-as szezon), 2003. október 1-től 2004. március 31-ig (2003/2004-es szezon) és a teljes időszakra (összesen), az említett időszakok 300 vagy 332 betegének összes csoportja alapján. 3.5 Kor szerinti megoszlás A hmpv-fertőzések életkori megoszlása a következő megoszlást eredményezte: újszülöttek (4 hetes életkor) n = 0 (0%), 5 hét-5 hónap n = 16 (14,03%), 6-12 hónap n = 20 ( 17,54%), 13-24 hónap n = 21 (18,42%),> 24 hónap n = 31 (27,19%). A hmpv-fertőzött betegek több mint fele 12 hónapnál idősebb volt, és a betegek több mint egyharmada 24 hónapnál idősebb volt. Az életkor 26 betegnél nem volt ismert (22,8%). Az adatok kor szerinti megoszlását a 7. táblázat mutatja. 55
22,80% 27,19% 0% 14,03% 18,42% 17,54% legfeljebb 4 hét 5 hét - 5 hónap 6-12 hónap 13-24 hónap 24 hónap felett ismeretlen 7. táblázat A hmpv-s betegek életkor szerinti megoszlása -fertőzés 2002. október 1. és 2004. március 31. között. 3.6 Szezonális lefolyás A 8. táblázatban látható kép a hmpv-fertőzések szezonális eloszlását eredményezte. A 2002/2003-as évfordulóra nincs egyértelmű szezonális felhalmozás, míg a 2003/2004-es szezonban egyértelmű maximum volt januárban. 30 25 20 15 10 5 0 hmpv 02/03 hmpv 03/04 október november decem ber január február március április 8. táblázat szezonális tendencia a hmpv-esetek számában a 2002/2003-as és a 2003/2004-es téli időszakokban 56
A 9. ábra: T1-súlyozott axiális MRI kép (A), koronális FLAIR (folyadék attenuált inverzió helyreállítása) (B) egy 14 hónapos betegről, hmpv-vel. Jelentősen növekszik a jelkéreg és a kéreg alatti; elváltozásokként értelmezik az encephalitis összefüggésében (Schildgen et al. 2005). A Bonni Egyetem Radiológiai Klinikája biztosítja. A 10. ábra ugyanazon beteg CT-képei 2 nappal az MRI után. Hypodense területek; általános agyödéma (pép és kéreg) jeleként értelmezik. Hyperdens felhalmozódás az arachnoid térben, amely az MRI-n még nem volt látható (Schildgen és mtsai 2005). A Bonni Egyetem Radiológiai Klinikája biztosítja 61