Kereten belüli géntörlési mutánsok előállítása a Pseudomonas aeruginosa-ban és a virulencia vizsgálata

Összegzés

Itt leírjuk a fertőzés egérmodelljének egyszerű és reprodukálható protokollját a Pseudomonas aeruginosa géntechnológiával módosított törzseinek gyengülésének értékeléséhez az Egyesült Államok Élelmiszer- és Gyógyszerügyi Hivatala (FDA) által jóváhagyott Escherichia coli kereskedelmi célú felhasználásához.

Absztrakt

Bevezetés

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Jegyzőkönyv

Az állatkísérletek megkezdése előtt az alkalmazandó protokollt az Állattenyésztési és -használati Intézményi Bizottságnak (IACUC) jóvá kell hagynia. A leírt protokoll jóváhagyását az IACUC kapta a Marshall Egyetemen (Huntington, WV, USA).

1. Genetikai deléció létrehozásához a pEX100T-NotI plazmid segítségével klónozzuk a DNS azon régióit, amelyek a kívánt deléciós szekvenciát határolják, és illesszük be őket a plazmid NotI restrikciós helyére. A plazmid inszertnek a célszekvencia előtt körülbelül 500 nukleotidot kell tartalmaznia, amelyek közvetlenül a cél törlési szekvencia után körülbelül 500 nukleotiddal szomszédosak. Ezenkívül a betétnek tartalmaznia kell a NotI felismerési szekvenciát (GCGGCCGC) annak 5 'és 3' végén (1. ábra)B.).

1. 1. lehetőség: használjon hagyományos klónozási technikákat. Használja PCR-t a genom régiók amplifikálásához a szóban forgó gén előtt és után, majd kövesse a 9., 10. keresztező PCR-t a keletkezett fragmensek összekapcsolására, a PCR-termék és a plazmid restrikciós endonukleáz emésztésével, valamint a 11. ligációval (1. ábra).IDŐSZÁMÍTÁSUNK ELŐTT).
2. 2. opció: A delico-szekvencia in silico megtervezése után tűrje meg, hogy a de novo szintetizáló vállalat beillessze a pEX100T-NotI plazmidba. Számos vállalat korszerűsítette a klónozás folyamatát a kívánt plazmid gyors és hatékony előállítása érdekében. Ezenkívül a szekvenciák a szállítás előtt ellenőrzik, hogy a plazmidok mutációmentesek-e.

1. Transzformáljuk az elektrokompetens E. colit a plazmiddal a gyártó ajánlása szerint. Steril oltási hurkot használva csíkozzon el 10 l transzformációs reakciót izolált kolóniákra egy előmelegített Luria Broth (LB) agar lemezre, amelyet 100 g/ml karbenicillinnel egészítettünk ki, és inkubálja egy éjszakán át 37 ° C-on.
   MEGJEGYZÉS: A baktériumok tenyésztésére használt összes berendezést és táptalajt az intézményi biztonsági irányelvek szerint kell kezelni.
2. Kétszer adja át.
   1. Vegye ki a lemezt az inkubátorból, és azonosítson egy izolált telepet. Steril oltóhurok segítségével vegye fel a telepet, és csíkozzon le egy előmelegített LB agar lemezt, amelyet 100 g/ml karbenicillinnel egészítettek ki az izolált telepek számára. Inkubáljuk egy éjszakán át 37 ° C-on. Ismételje meg ezt a lépést a tiszta kultúra létrehozásához.
3. Steril oltási hurok segítségével oltsunk be 5 ml LB-t egyetlen teleppel az utolsó agarlemezről. Helyezze a tenyészetet egy éjszakán át rázó inkubátorba 37 ° C-on. Másnap keverjen 1 ml e tenyészetet 1 ml 5% -kal egy kriovialban, és -80 ° C-on tárolja, hogy a fagyasztott állomány létrejöjjön.

4. Bakteriális denzitás-előkészítés és háromoldali konjugáció

5. P. aeruginosa egyszeres keresztező rekombinánsok kimutatása

6. A P. aeruginosa kettős kimutatása rekombinánsok felett

1. Minden húsleves tenyészethez oltsunk be 10 liter tenyészetet egy előre felmelegített PIA lemezre, kiegészítve 10% -os szacharózzal (glicerin nélkül) és az izolált telepek csíkjaival. Inkubálja a lemezeket egy éjszakán át 37 ° C-on.
2. Másnap vegye ki a lemezeket az inkubátorból, és vizsgálja meg a növekedést. A szacharóz-rezisztens telepeknek kettős keresztezésű rekombinánsoknak kell lenniük (vagyis a plazmid inszert másik homológ régiója és a P. aeruginosa kromoszóma között rekombinációs eseményen keresztül távolították el a plazmidot a kromoszómából).
   1. Harapjon fel legalább 20 kolóniát steril fogpiszkálóval az előmelegített lemezeken: 1) PIA, 2) 10% szacharózzal (glicerin nélkül) PIA és 3) 300 g/ml karbenicillinnel kiegészítve PIA.
3. Inkubálja a lemezeket egy éjszakán át 37 ° C-on.
4. Vegye ki a lemezeket az inkubátorból, és vizsgálja meg növekedésüket. Az igazi kettős keresztezésű rekombinánsok karbenicillin-érzékenyek és szacharóz-rezisztensek lesznek (azaz olyan telepek, amelyek PIA-n és PIA-n nőttek szacharózzal kiegészítve, de nem növekedtek karbenicillinnel kiegészített PIA-n).

7. A gén törlésének megerősítése Colony PCR-en keresztül

8. Készítse elő a baktériumtörzset az állatkísérletekhez

VE2 és PGN5:
aroA F: GCGAACGCCAACAGCCGATAAAGC
aroA R: ATCTGGCTCGATGCCGGTCC

Inkubáljuk a tenyészeteket rázó inkubátorban 160 fordulat/perc és 37 ° C hőmérsékleten, amíg el nem érik a log fázis növekedést (azaz OD600 mérése 0,4-0,6 spektrofotométeren).

Az elért log fázisból nyert OD600 segítségével számítsa ki a húsleves térfogatát, amely 2,5 x 109 telepkép-egység (CFU)/ml mennyiséghez szükséges. Pelletezzük a húsleves térfogatát 50 ml-es csövekben 4500 x g-vel 10 percig.

Dobja el a felülúszót, és helyezze az üledéket csőbe 50 ml 1x PBS-sel a sejtek mosásához. Centrifugáljuk újra 4500 x g sebességgel 10 percig.

Dobja el a felülúszót, és szuszpendálja újra a pelletet 25 ml 5% fölözött tejben 1x PBS-ben.

1. Érvényesítési lépés: A 25 ml-es újraszuszpenzió mintájával végezzük az életképes lemezszámlálást a CFU/ml számának meghatározásához.

A 25 ml sovány tejtenyészet újraszuszpenzióját 2 ml-es tenyészállományban 2 ml-es krioviálban osztjuk szét. Fagyassza le a folyékony nitrogénben a villanást, és használat előtt legalább egy éjszakán át -80 ° C-on tárolja.

9. Az állatkísérletekhez megtakarított növekedési és törzsállományok validálása.

1. Minden vizsgálandó fajtához távolítson el legalább 3 kriovialt a fagyasztott állományokból -80 ° C-os tárolásból, és 4 ° C-on 2-4 órán át olvasztsa fel. Ha fagyott táp marad meg, melegítse rövid ideig 37 ° C-ra.
2. Minden kriovialból vegyen kis mintákat az egyes fajták hitelesítéséhez.
   1. Végezzen életképes lemezszámlálást a CFU/ml számának meghatározásához. Normális, hogy fagyás után kevesebb CFU/ml van, néhány baktériumsejt halála miatt.
   2. Minden törzs validálásához használjon PCR-t és stretch-specifikus primereket.
   3. Húzza az egyes nyomtatásokat szelektív hordozóra a fenotípus ellenőrzéséhez.
3. Miután megerősítette, hogy a törzsek megfelelő genotípusúak és fenotípusúak, és hitelesítette a CFU/ml-t, térjen át az állatkísérletekre.

10. Az állatok baktérium törzsekkel történő beoltása injekcióval

11. Az állatok mortalitásának statisztikai elemzése

12. Vizualizálja a fertőzést biolumineszcenciával

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Reprezentatív eredmények

Mint a 2. ábránMint látható, a megcélzott genomiális deléció kolónia PCR-rel igazolható specifikus primerekkel, amelyek megerősítik az érdeklődési területet. A genomiális deléciót hordozó telepek rövidebb PCR sávméretet eredményeznek, mint a vad típusú telepek. A 10-12 telepet tartalmazó PCR-szűrés általában elegendő legalább egy, a célzott deléciót hordozó kolónia kimutatására. Ha a törléseket a képernyő több fordulója után sem észleli, ismételje meg a konjugációval kezdődő folyamatot. Ha a törlés továbbra sem sikerül, akkor a plazmid telepítését szekvenálással, újratervezéssel vagy végzetes szekvenciával kell megerősíteni. Miután ellenőrizte a gén delécióját PCR-en keresztül, erősítse meg a deléciót szekvenálással. A kapott törzset ismételten alávethetjük a folyamatnak, hogy szekvenciális genomiális módosításokat hozzunk létre.

Mint a 3. ábránamint az látható, a P. aeruginosa PGN5 (+ mucE) attenuált törzsének intraperitoneális injekciójával járó mortalitás 0% volt, ami megegyezett az E. coli BL21 esetében megfigyeltével. Másrészt a szülő törzs (VE2) intraperitoneális injekciója az egerek 80% -ának végzetes volt. Ezeket az eredményeket az injektált törzsek validálásának kiterjedt lépéseivel érték el. Noha ezekben az egerekben a halál pontos oka ismeretlen, legalább részben visszavezethető a szülőtörzsben levő virulencia faktorok expressziójára, amelyeket töröltünk a csillapított PGN5 törzsből. A fertőzés progressziójának különbségeit biolumineszcenciával jelölt szülőkkel és attenuált törzsekkel követtük. Az attenuált szár az injekció beadásának helyén addig maradt, amíg a biolumineszcencia elhalványult (4. ábra). A fertőzés kiürülése nagy valószínűséggel egybeesett a biolumineszcencia fakulásával. A biolumineszcenciát 24 órával az injekció beadása után nem észlelték, és az egerek az injekció után hetekig éltek, amíg fel nem áldozták őket, mellékhatások nélkül.

2. ábra: A kolónia PCR-termékeinek gélelektroforézise aroA-deléciós szűrőről az attenuált P. aeruginosa törzs, PGN5 előállításához. A 2-5. És a 8-11. Sávon futó telep PCR-termékek vad típusú aroA-val rendelkező telepeket mutatnak. A 6. és 7. sávban futó kolónia PCR-termékek a korszak gén delécióját hordozzák, amelyet a kisebb PCR termék (sárga csillag) jelez. Az alkalmazott primerek specifikusan fokozták az aroA gént tartalmazó aromás régiót: aroA-F: GCGAACGCCAACAGCCGATAAAGCUND és aroA-R: ATCTGGCTCGCTCTGCCGGTCC. A vad telepekben várható PCR-termékméret 2548 nukleotid (nt) volt. A várt PCR termékméret az aroA delécióval rendelkező telepekben 307 nt volt. DNS-létra vezetett az 1. és 12. sávban. A kép nagyobb verziójának megtekintéséhez kattintson ide.

3. ábra: Patogén P. aeruginosa törzzsel (VE2), attenuált P. aeruginosa törzzsel (PGN5 + mucE) és FDA kontroll E-vel fertőzött egerek teljes mortalitása. coli törzs (BL21). Csak a patogén szülőtörzzsel injektált egerek halálozási aránya 80% volt. Csökkentett P. aeruginosa törzs és FDA kontroll. a coli törzs mortalitása 0% volt. A kép nagyobb verziójának megtekintéséhez kattintson ide.

4. ábra: Az egér képe 3 órával a P. aeruginosa PGN5 + mucE legyengített törzsének biolumineszcens markerrel történő injektálása után. A biolumineszcens baktériumok az injekció beadása után 18-24 óráig voltak kimutathatók. Ez idő alatt a biolumineszcencia az injekció helyén maradt, ami arra utal, hogy a baktériumok az injekció beadásának helyén maradtak. Ez az egér teljesen felépült, káros hatások nélkül. A kép nagyobb verziójának megtekintéséhez kattintson ide.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Vita

A pEX100T-Not1 plazmid hatékony közvetítője a szekvenciális, marker nélküli és keretben lévő genomi delécióknak. Amikor baktérium törzseket fejlesztenek az attenuált virulencia érdekében, a teljes génszekvenciák törlése ahelyett, hogy pontmutációkat generálna, csökkenti a virulens fenotípushoz való visszatérés esélyét. Ezenkívül minden patogenitási gén deléció tovább csillapítja a kórokozót és növeli a csillapítás stabilitását.

Ezt a módszert fel lehet használni a delécióktól eltérő genomiális módosítások, például a pontmutációk és az inszerciók létrehozására is, egyszerűen megváltoztatva a plazmid inzert tervét. Az ilyen típusú módosítások hasznosabbak lehetnek, mint például a módosított metabolizmusú technikai baktériumok teljes géndeléciói. A szekvenciális genomiális modifikáció jelentős potenciállal rendelkezik a tervező baktériumtörzsek előállításában a kutatás és az ipar speciális céljaira. A baktériumokban a kívánt marker nélküli genomiális módosítások előállításának egyéb módszereit 15., 16., 17., 18. ismertették. Mint minden genomszerkesztési módszer, az alapvető genomterületek módosítási kísérletei is végzetesek lehetnek, ezért sikertelenek. Ezekben az esetekben a különféle genetikai módosítások vagy más jelölt gének azonosítása szükséges az érdeklődésre számot tartó baktériumtörzs előállításához.

Tekintettel az egyes telepek számos replikációs eseményére és passzusára ebben a protokollban, szándékolatlan változások következnek be a termesztett faj genomjában. A pontos genomiális változások a teljes genom szekvenálásával azonosíthatók. E változások hatásait azonban nehezebb meghatározni. Ha baktériumokat fejlesztenek ki egy adott célra, akkor elfogadhatók azok a genomiális változások, amelyek nem befolyásolják negatívan a szervezet növekedését vagy a célpályákat. A keletkezett törzstől függően lehetséges lehet egy "leolvasás" azonosítása annak biztosítására, hogy a fajta továbbra is hasznos legyen a rendeltetésének megfelelően. Például a PGN5 alkalmazásával egy olyan legyengített fajta létrehozása volt a cél, amely megtartotta a nagy mennyiségű alginát előállításának képességét. Öt patogenitási gén törlése után megmértük a PGN5 által termelt alginát mennyiségét és összetételét, és összehasonlíthatónak találtuk más alginátot termelő törzsekkel. Az algináttermelést nem befolyásolta sem az öt géndeléció, sem a PGN5 kifejlődése során bekövetkezett nem szándékos genomiális változások.

A biolumineszcencia markerként történő alkalmazása lehetővé teszi az injektált baktériumtörzsek további validálását, mivel a marker az injekció helyén látható. A biolumineszcens marker beillesztése a baktériumok kromoszómájába szükséges a biolumineszcens képalkotáshoz, de nem biztos, hogy inkompatibilis törzsekkel/fajokkal dolgozik. A törzsek biolumineszcenciával történő jelölése azonban nem szükséges a csillapítás teszteléséhez. Az ebben a vizsgálatban tesztelt törzseket biolumineszcenciával jelöltük, amely lehetővé tette a törzsek közötti lokalizációs különbségek vizualizálását a fertőzés során. Megfigyeltük, hogy a patogén törzs átterjedt az egér testén, de a nem patogén törzs az injekció helyén maradt. Míg ez a kísérlet csak két nagyon szoros rokonságban lévő P. aeruginosage törzset tesztelt, azt sugallja, hogy a baktériumok terjedése összefügg a virulenciával, legalábbis a P. aeruginosa-ban. A biolumineszcenciával történő címkézésnek ezt a módszerét fel lehet használni a fertőzés előrehaladásának megjelenítésére a jövőben, a technikai baktériumtörzsek gyengülésének gyors felmérése érdekében.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Közzétételek

A szerző, Hongwei D. Yu, a Progenesis Technologies, LLC tudományos vezérigazgatója és társalapítója.

---