Kromatográfia

Kromatográfia vagy. Kromatográfia (Görög, németül Színes írás) A kémia során olyan eljárást nevezünk, amely lehetővé teszi az anyagok keverékének elválasztását úgy, hogy az egyes komponenseit eltérő módon osztják el egy álló és egy mobil fázis között. Ezt az elvet 1901-ben, az orosz botanikus, Michail S. Tswett írta le először, 1903-ban írták le először a nyilvánosság előtt, 1906-ban pedig először a "kromatográfia" kifejezést használta. Színes gyógynövénykivonatokat vizsgált, például levélanyagból, és kromatográfiával különféle színezékeket tudott elkülöníteni tőlük. Ezt a módszert a gyakorlatban egyrészt az anyagok elkülönítésére vagy tisztítására (= preparatív kromatográfia), másrészt a kémiai elemzés során használják az anyagok keverékeinek az azonosítás vagy a mennyiségi meghatározás céljából a lehető legegyenletesebb összetevőkre történő szétválasztására. A kromatográfia a mai szerves kémia, biokémia, biotechnológia, mikrobiológia, élelmiszer-kémia, környezeti kémia és szervetlen kémia szerves részévé vált.

További ajánlott szakismeretek

Magasabb mérési teljesítmény 6 egyszerű lépésben

Mi a helyes módszer az ismételhetőség mérlegen történő ellenőrzésére?

A pipetták gyors ellenőrzése?

Tartalomjegyzék

A kromatográfiai eljárás leírása

A kromatográfia legegyszerűbben összehasonlításával magyarázható:

A tomboló folyó elég sok lebegő törmeléket hordozhat. Az úszó törmelék mozgatásának sebessége függ

az úszó törmelék típusa (a homokszemeket gyorsabban szállítják, mint a kavicsokat),
a folyómeder jellege (az érdes felületek növelik az úszó törmelék súrlódását és ezáltal csökkentik az eltávolítás sebességét) és
az áramlási sebességen.

A kromatográfiában anyagok keverékeit (= úszó törmelék) használják az ún Mobil fázis (= Víz) egy Helyhez kötött fázis (= Folyómeder) tovább szállítva. A minta, az állófázis és a mozgófázis közötti kölcsönhatások miatt (lásd a szétválasztási elvek szerinti felosztást) az egyes komponensek különböző sebességgel szállíthatók tovább, és így elválaszthatók egymástól: Egy helyen homok, nagyon kicsi és kissé nagyobb kavics keveréke képződik behozta a folyó; száz méter után például először az összes homok megérkezik (néhány méteren szétszórva), és egy bizonyos várakozási idő elteltével jönnek az összes kisebb kavicsok, és jóval később a nagyobbak is, mindegyik húzott egy bizonyos távolságot.

Könnyebb megérteni egy példával: Ha az A molekulák 45% -a mobil fázisban van (átlagosan), akkor a dinamikus egyensúly azt jelenti, hogy az egyes A molekulák is a mobil fázisban vannak az idő 45% -ában Töltési szakasz (átlagosan). Ezért sebességük átlagosan a mobil fázissebesség 45% -a lesz. A kromatográfiában elért jó eredmények elérése érdekében elengedhetetlen, hogy az anyagok cseréje a két fázis között nagyon gyorsan megtörténjen, vagyis az egyes mintamolekuláknak gyakran vissza-vissza kell váltaniuk a két fázis (diffúziós folyamatok, hőmozgás) között. Ennek előfeltétele, hogy azok az utak, amelyeket a molekuláknak meg kell haladniuk az álló fázistól a mobil fázisig, nagyon rövidek. Ha az álló fázis porot tartalmaz, ennek a pornak szemcseméretének nagyon kicsinek kell lennie (például csak néhány mikrométer). Bizonyos okokból a porszemeket is a lehető legegyenletesebben kell formázni, és a lehető legegyenletesebb méretűnek kell lenniük (keskeny szemcseméret-eloszlás).

folyamat

A kromatográfiához meg kell állapítani a mozgófázis áramlását, az elválasztandó minta befecskendezését, a tényleges elválasztást és a kimutatást. A A mobil fázis áramlása vagy nyomással (hidraulikus szivattyú, gáznyomás), kapilláris erővel vagy elektromos feszültség alkalmazásával érhető el.

A injekció (= Az anyagkeverék bevezetése a kromatográfiai rendszerbe) vagy a mobil fázis áramlásának megalakulása előtt történik (például vékonyréteg-kromatográfia), vagy addig, amíg a mobil fázis már folyik. Nagyszámú minta esetén úgynevezett autosmintákat használnak az automatizálható kromatográfiához (saját adatgyűjtő rendszereikkel együtt), amelyek a mintákat teljesen automatikusan injektálják.

Aztán a tényleges Az anyagkeverék elválasztása az izoláló távolságon. Nélkül Érzékelés A kromatográfia nem képzelhető el (= egyértelművé téve, ha egy anyag áthalad a kromatográfiai rendszer egy bizonyos részén, vagy ha egy anyag leáll a folyamat befejezése után). Különböző detektáló rendszereket alkalmaznak a kromatográfiák mindegyik típusához, vagy az anyagok fizikai tulajdonságainak (fényelnyelés, fluoreszcencia, fényszóródás, hővezető képesség stb.) Felhasználásával, vagy kémiai reakciók útján történő jelzéssel. Kémiai reakciók útján pl. Színt kapunk síkkromatográfiával (pl. Aminosavak ninhidrint használva), vagy a reakciókat szétválasztás (oszlop előtti derivatizálás) vagy elválasztás (oszlop utáni derivatizálás) után végezzük oszlopkromatográfiában.

A preparatív kromatográfiában a Frakciós gyűjtők szükséges az elválasztott anyag összegyűjtéséhez.

A kialakítás miatt a kromatográfiás tisztítási eljárások mindig szakaszos folyamatok. Ez azt jelenti, hogy csak bizonyos mennyiségű anyag alkalmazható és szétválasztható a következő mennyiség folytatása előtt. Ez különösen problematikus nagy mennyiségek feldolgozásakor, így néhány eljárást kidolgoztak a kromatográfia folyamatos működtetése érdekében: gyűrűs kromatográfia, TMB (True Moving Bed) és SMB (Simulated Moving Bed) kromatográfia.

Néhány kifejezés meghatározása

Helyhez kötött fázis

Olyan fázis, amely kölcsönhatásba lép az anyagkeverék egyes anyagaival és nem mozog. Az analitok retenciójuk alatt való tartózkodása váltakozik a mozgó és az álló fázis között (véletlenszerű séta), és az anyagra jellemző retenciós időt idézi elő.

Mobil fázis

Fázis, amelyben az anyagkeveréket az elválasztórendszer elején bevezetik és mozgatják (szilárd vagy folyékony anyag fázisa). A mobil fázisok elúciós képességükben különböznek ("Erősség" lásd az "Elutrope tartomány" alatt), ez különböző retenciós időket és gyakran eltérő szelektivitást igényel.

Visszatartás

Az anyagkeverék egyes anyagainak késleltetése az álló fázissal való kölcsönhatás révén.

Késleltetési idő

Az az idő, amely alatt a tiszta anyag molekuláinak át kell vándorolniuk az oszlopon (az injekciótól a detektálásig).

Áramlási idő (holtidő)

Az áramlási idő (korábban "holtidő" is) azt az időt jelzi, amelyre a mobil fázisnak vagy egy nem visszatartott anyagnak át kell vándorolnia az oszlopon. Nem visszatartott anyag (Inert anyag) csak elhanyagolhatóan alacsony koncentrációban van az álló fázisban, és ezért a mozgó fázissal egy időben halad át az oszlopon.

Elúció

Elúció (lat. eluátum "Kimosás") az adszorbeált anyagok kioldása vagy kiszorítása szilárd vagy folyadékkal átitatott adszorbensekből és ioncserélőkből egy oldószer folyamatos hozzáadásával (Eluent = mobil fázis). Az elválasztó oszlopból kifolyó oldat Eluate hívott.

Ez a folyamat különösen fontos a szilárd fázisú extrakcióban.

Eluent

Mobil fázis, amely túllépte az izolációs távolságot.

Eluotropikus sorozat

Az általában mozgófázisként alkalmazott oldószerek elúciós teljesítményük szerinti elrendezése egy referenciaanyaggal (általában szilikagél vagy alumínium-oxid). Az elrendezés választható növekvő vagy csökkenő sorrendben.

Kromatográfia

Oszlop: A kromatográfiában az oszlop egy üreges cső, amelynek átmérője néhány mikrométer és több méter között van. Ez a cső vagy teljesen tele van álló fázissal (töltött oszlop), vagy vékonyan van bevonva a belsejében (kapilláris oszlop).

Fordított fázisú mechanizmus

Kétféle módon lehet szétválasztani egy anyagkeveréket az adszorpciós kromatográfiában:

Normál fázis: poláros állófázis (például szilikagél, alumínium-oxid), nem poláros vagy közepes poláros mozgó fázis (például HC-anyagok, dioxán, etil-acetát) vagy
Fordított fázis (Fordított fázis): nem poláris állófázis (mint a módosított szilikagél) és a poláros mozgófázis (például pufferolt víz).

Az első esetben a lipofil anyagok könnyen eluálhatók, a poláros anyagok nehezen eluálhatók, fordított esetben pedig a poláris anyagok könnyen eluálódnak ("similia similibus solvuntur").

A HPLC-ben gyakran gradiens elúciót alkalmaznak (fordított fázis), amelyben az oldószer összetétele lassan megváltozik (például 80% -ról 20% víztartalomra). Az oszlopok nagyon későn, az aminosavak pedig nagyon korán jelennek meg, és ezek a frakciók kivághatók.

A kromatográfiás elválasztási módszerek különböző szempontok szerint osztályozhatók:

Osztályozás az elválasztási elv szerint

Valamennyi kromatográfiai eljárás alapelve az egyensúly és a mozgó fázis közötti egyensúly gyakran megismétlődése. Az egyensúly a különféle fizikai-kémiai hatások miatt kialakulhat.

Osztályozás az alkalmazott fázisok szerint

A mobil fázisok miatt a kromatográfia három területre osztható, amelyek az állófázisok hordozói vagy az állófázisok fizikai állapota szerint különböző csoportokra oszthatók.

Kromatográfiai paraméterek

Menetoszlop hossza L.

Áramlási időt0

Késleltetési időtR.

u lineárisnak nevezzük Áramlási sebesség a mobil fázist az oszlopon keresztül, ez a következő:

a Megtartási tényezők által meghatározott

A Α elválasztási tényező két anyag elválasztásának minőségét jelzi. A retenciós időkön alapul tR. oszlopban található összetevők közül. A retenciós idő az az idő, amelyre a vizsgált komponensnek át kell haladnia az oszlopon, és a csúcsmaximumon jelenik meg:

R., a kromatográfiai felbontás (felbontás) két csúcsot az alábbiak alapján számolunk:

vagy

, a Az elválasztási szakaszok száma vagy Tálcák száma leírja az oszlopban álló és a mozgó fázis között elválasztandó anyag egyensúlyi beállításainak számát. Minél nagyobb az N, annál egyensúlyi beállítások hajthatók végre egy bizonyos hosszúságban, ami az oszlop jobb elválasztási teljesítményét eredményezi. Az N-t a következő képlet segítségével számoljuk:

vagy

B.: Alapvonal szélesség

F.W.HM.: "Teljes szélesség a maximum felénél" Fwhm

: Csúcskapacitás; Jelzi, hogy hány csúcs van egy intervallumon belül t0 és egy bizonyos csúcs k-értéke elméletileg elválasztható egymástól R = 1 felbontással.

H jelöli a Elválasztási lépés magassága (vagy elméleti padlómagasság), és ez az oszlop hossza és a tálcák száma aránya:

A gyakorlati értékek 0,1 és 0,5 mm között vannak.

Partíció magassága H

A kromatográfiai oszlop elválasztási lépésmagassága az oszlop elválasztási hatékonyságának a mértéke. Az elválasztási szakasz úgy képzelhető el, mint az elválasztó oszlopnak az a szakasza, amelyen a kromatográfiai egyensúly megteremtődött. Minél több ilyen egyensúlyi beállításnak "van helye az oszlopon", annál alacsonyabb az elválasztási szakasz magassága és annál nagyobb az oszlop elválasztási hatékonysága. Alacsony elválasztási lépés eléréséhez a magasság elemző alatt körülmények a következő követelményekre van szükség:

Az adszorpció vagy az eloszlás gyors egyensúlya várható. Ezért a részecske átmérőjének a lehető legkisebbnek kell lennie.
Állandó hőmérséklet az oszlopban. Ehhez oszlopos termosztát használható.
Állandó áramlási sebesség: Ehhez legfeljebb 400 bar nyomású dugattyús szivattyút használnak.
Lineáris adszorpciós tartomány: Az állófázist nem szabad túlterhelni a kromatográfia során.
Kívánatos lenne az elhanyagolható diffúzió, de sajnos kísérletileg nem érhető el. Ezért a lehető legszabályosabb, különösen kis átmérőjű részecskéket tartalmazó csomagolásokat alkalmazzuk.

A HPLC úgynevezett Van Deemter-egyenletével meghatározható az elválasztási szakasz magassága az eluens áramlási sebességének függvényében:

H az elválasztási lépés magassága,
ux a lineáris áramlási sebesség.
A. -kifejezés figyelembe veszi az örvénydiffúziót, amely a csomagoláson keresztül különböző áramlási utakból származik. A következő vonatkozik: hol
- o a csomagolási tényező,
- d a részecske átmérőt jelöli.
A B. -kifejezés figyelembe veszi a hosszanti diffúziót. A hosszanti diffúzió az analit molekulák diffúziója a szétválasztási szakasz mindkét irányában. A következő vonatkozik: ahol:
- D. a diffúziós állandó a mobil fázisban és
- L. az útvesztő tényező. A labirintus faktor figyelembe veszi az álló fázis pórusszerkezetét.
a C. -kifejezés figyelembe veszi a csúcsszélesedést a mozgó és az álló szakasz közötti egyensúly lassú kialakulása miatt. Itt van a diffúziós állandó is D. az állófázis pórusai mentén figyelhető meg. Ez érvényes

Csúcsszimmetria

Elméletileg minden anyagnak éles eluáló vonalként el kell hagynia a kromatográfiás oszlopot. Különböző okokból azonban a kromatográfiás csúcsok mindig bizonyos szélességűek. Ideális esetben egy Gauss-féle haranggörbe alakúak. A gyakorlatban azonban gyakran előfordul, hogy a csúcsok eltérnek ettől az ideális formától, és többé-kevésbé aszimmetrikusnak tűnnek. Olyan aszimmetriát, amelyben a csúcs elülső emelkedése meredekebb, mint a csúcs esése, „farokként” nevezzük, míg azt a hatást, hogy az emelkedés kevésbé meredek, mint a zuhanás, „homlokzatnak” nevezzük. A farokfaktort, amely a csúcsszimmetria mértéke, úgy határozzuk meg, hogy a merőlegest eldobjuk a csúcsmaximumtól az alapvonalig, és egy bizonyos magasságban, általában a csúcsmagasság 10% -át, a csúcsfrontig terjedő távolságokat (a) és a csúcsvégeket (b) ) meghatározott. Ezután a két érték hányadosa képződik, ahol különböző számítási képleteket használnak (például az IUPAC vagy az USP szerint):

Az ideális "Gauss-csúcs" eléri az 1-es értéket, az 1 feletti értékek a "farok", az 1 alatti értékek a "homlok".

Gyakorlati kísérlet

A kromatográfiát otthon végezhetjük kereskedelemben kapható eszközökkel. Szükséged van:

szűrőtáska, ha lehetséges, fehér vagy fekete
néhány színes ceruza a vízoldható fajtából és feltétlenül jelölőtollak, amelyek nem vízoldhatók.

Festéket alkalmaznak a kávészűrő alsó szélére, és a papírt vízzel egy tálba helyezzük, hogy a papír felszívódjon vízzel.

Mivel a zsírkréták színe vízben oldódik, a víz immár felfelé szállítja a színt.

A piros ceruza például alapvetően nem piros, hanem különböző színek keverékéből áll, amelyek együtt vörösnek tűnnek. A kísérlet során a különböző színű pigmentek különböző mértékben kölcsönhatásba lépnek a papírral, és így a víz többé-kevésbé gyorsan szállítja őket.

Ennek eredményeként hamarosan több különböző színű foltot láthat, a zsírkréta színeit kromatográfiásan különítik el.

Annak érdekében, hogy teszteljük az elválasztásnak az oldószertől való függőségét, ismét elvégezhetjük ezt a kísérletet ugyanazzal a tollal vodkával, tisztító benzinnel vagy denaturált alkohollal, és megfigyelhetjük a különböző eredményeket. (Ezt azonban csak jól szellőző helyiségekben szabad megtenni, mivel a benzin tisztításának füstje mérgező.)