Krónikus szalmonellával fertőzött egérmodell protokoll (németre fordítva)

Összegzés

Hozzon létre egy krónikus bakteriális fertőzésű egérmodellt, amelynek tartós Salmonella Typhimurium kolonizációja van a bélben 27 hétig.

Absztrakt

A bakteriális fertőzéses egérmodell hatékony modell olyan területek tanulmányozására, mint a fertőzés, a gyulladás, az immunológia, a jelátvitel és a tumorgenezis. Sok kutató kihasználta a Salmonella Typhimurium által kiváltott vastagbélgyulladást a gyulladás és a fertőzés korai szakaszának tanulmányozásához. Krónikus fertőzésről azonban kevés jelentést tesznek in vivo. A gyomor-bél traktusban állandóan fennálló szalmonellás egerek lehetővé teszik számunkra a hosszú távú gazda-baktérium kölcsönhatás, a jelátvitel és a tumorgenezis feltárását. Megállapítottunk egy krónikus bakteriális fertőzéses egérmodellt, Salmonella Typhimurium kolonizációval az egér belében 6 hónap alatt. Ennek a rendszernek a használatához meg kell tanulni a kutatónak a baktériumtenyészet előkészítését és az állatok szoptatását. Részletezünk egy módszert a baktériumtenyészet és a szoptató egerek előállítására. Megmutatjuk azt is, hogy a Salmonella miként detektálja a perzisztenciát a gyomor-bél traktusban. Összességében ez a protokoll segít a bakteriális fertőzéses egérmodell kutatóinak alapvetően megválaszolni a biológiai és mikrobiológiai kérdéseket.

Jegyzőkönyv

Ennek a protokollnak három része van: baktériumtenyészet, egér nasogastricus cső és szalmonella kimutatása.

1. A szalmonella növekedési állapota.

  1. Készítse elő a Salmonella Luria-Bertani Broth (LB) lemezt, inkubálja 37 ° C-on egy éjszakán át.
  2. Válasszon egy klónt az LB lemezről, helyezze 7 ml LB-be egy 12 ml-es csőbe, és rázza 37 ° C-on körülbelül 5 órán át.
  3. 50 ml LB-t beoltunk 0,05 ml tenyészet álló fázisával és 37 ° C-on, 18 órán át rázás nélkül.
  4. Centrifugáljuk egy éjszakán át a baktériumkultúrát szobahőmérsékleten, 6000 fordulat/perc sebességgel 10 percig, hogy a baktériumokat 100: 3 arányú HBSS-ben szuszpendáljuk (LB: HBSS). Például:
    Minden 50 ml LB tenyészetet szuszpendálunk 1,5 ml HBSS-ben.
  5. Az állat etetőcsövéhez tovább hígítsa a baktériumtenyészetet 1:10 arányban. Például:
    Minden 1,5 ml LB tenyészetet 15 ml HBSS-ben szuszpendálunk.

2. Salmonella fertőzés modellje *.

  1. Készítsük el a sztreptomicin oldatot. Minden egérnek 7,5 mg sztreptomicint adunk 100 ul HBSS-ben. Például készítsen összesen 90 mg sztreptomicint 1,2 ml HBSS-ben 10 egér számára. A sztreptomicin oldat elkészítésekor mindig valamivel nagyobb mennyiséget kell adni.
  2. Az orális kezelés előtt 4 órával vegyen ki vizet és ételt.
  3. 7,5 mg streptomicinnel (100 µl HBSS a kontroll egerekhez) sztreptomicint tartalmazó egerek. Húzza meg a hüvelykujjával és a középső ujjával az egér vállán a bőrt, mutatóujjával egyenesítse meg a fejet és a nyakat a nyelőcső kiegyenesítéséhez. Igazítsa az etető tű gömbhegyét a száj tetejére és a torok hátsó részének jobb oldalára, majd óvatosan vezesse le a nyelőcsőbe, és fecskendezze be a 100 μl oldatot. Semmi ellenállást nem szabad érezni.
  4. A sztreptomicin-kezelés után 20 órával a vizet és az ételt ismét visszavonják, mielőtt az egereket baktériummal fertőznék.
  5. Minden egeret orálisan adagoljon 100 ul HBSS-szuszpenzióval vagy steril HBSS-szel (kontroll) kezelt egerekkel. A szondázási eljárás megegyezik a sztreptomicint tartalmazó 2,3) szondával ellátott egerekkel.

* Állatkísérleteket végeztek specifikus kórokozóktól mentes 6-7 hetes C57BL/6 nőstény nőstényekkel (Taconic, Hudson, NY) a fent leírtak szerint 1. A protokollt a Rochesteri Egyetem Állati Erőforrások Bizottsága (UCAR) hagyta jóvá.

3. Salmonella kimutatása a belekben.

  1. Gyűjtse össze az ürüléket az egérrel (kb. 100 mg).
  2. Vigye a székletmintát 1,5 mikrocentrifuga csőbe 1 ml PBS-sel, és erőteljesen keverje át.
  3. Centrifugáljuk 10 percig, 800 fordulat/perc sebességgel. Helyezze a felülúszót egy tiszta mikrocentrifuga csőbe.
  4. Centrifugálás 6000 fordulat/perc sebességgel 5 percig. A felülúszót eldobjuk, és a pelletekhez 200 μl PBS-t adunk, majd vortexeljük.
  5. A Salmonella kimutatásához csepegtesse a 200 μl PBS-t eldobható sejtrázóval egy BBL CHROMagar lemezre. A szalmonellák mályvaszínűek (rózsaszíntől liláig, lásd 1. ábra). Ha 200 μl túl sok kolóniát eredményez a lemezen, használjon 100 μl vagy 50 μl csíkot.

4. Reprezentatív eredmények.

Ha a protokollt helyesen hajtják végre, a Salmonella typhimurium kolonizáció több mint 6 hónapig kimutatható az egér belében. A szalmonellát székletkultúrán keresztül lehetett kimutatni 6 hónap alatt (1. ábra). Ahogy ez a modell jellemző, a testsúlycsökkenés és a halál a fertőzés után 4 héten belül bekövetkezik. A fertőzéshez használt Salmonella törzsektől függően egyes egerek nem élhetnek túl 6 hónapnál tovább.

németre
1. ábra. A Salmonella fajok bélbeli szalmonellája mályva (rózsaszíntől liláig) színűnek tűnik, a kiválasztott kromogének jelenlétében bekövetkező metabolikus különbségek miatt. Más baktériumok vagy gátoltak, vagy kék-zöld vagy színtelen telepeket hoznak létre.

egérmodell
2. ábra. Salmonella mutáns PhoP c, PhoP c Avra- és PhoP c AvrA-/AvrA +, PhoP c Avra ​​fertőzött egerek túlélési aránya 4 héten (28 napon).

Asztal 1. 4 hétig szalmonellával fertőzött egerek testsúlya.

0 1 hét 2 hét 3 hét 4 hét
ellenőrzés 16,78 ± 1,05 16,91 ± 1,28 18,26 ± 1,23 19,31 ± 1,26 20,26 ± 1,15
PhoP c 16,89 ± 1,03 17,14 ± 1,19 17,43 ± 1,63 * 18,68 ± 1,78 20,05 ± 1,11
PhoP c Avra- 16,91 ± 1,12 16,96 ± 1,39 17,06 ± 2,14 ** 18,71 ± 2,18 20,15 ± 1,56
PhoP c AvrA-/AvrA + 16,94 ± 0,96 17,17 ± 1,02 17,63 ± 1,42 * 18,44 ± 2,03 20,09 ± 1,17

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Vita

Ennek a rendszernek a használatához meg kell tanulnia a kutatóknak az állatok etetését nasogastricus csövön keresztül. Részletezünk egy módszert a baktériumtenyészet előkészítésére és az egerek szoptatására. Megmutatjuk azt is, hogy miként lehet monitorozni a szalmonella perzisztenciát a gyomor-bélrendszerben (GI traktusban). A protokoll kritikus lépései a következők:

  1. Sztreptomicin előkezelés: A sztreptomicin előkezeléssel megszabadulhat néhány kommenzális bélflóra, és az egerek fogékonnyá válhatnak a szalmonella fertőzésre 2.
  2. Salmonella etetőcső: A kezdő számára az etetőcső jelenthet kihívást. Valamikor egy nasogastricus cső meghibásodik, mert az oldatot véletlenül befecskendezik a légutakba, és egérhalált okoz.
  3. Tartós baktériumok kolonizációja: szoros monitorozásra szorulnak a baktériumok a gyomor-bél traktusban. Az egér ürülék tenyésztése mellett a függelék tartalma felhasználható a szalmonella kimutatására BBL CHROMagar lemezeken is. Gyűjtse össze a függelék tartalmát, amikor egereket áldoz fel a Salmonella fertőzés után.

Különböző koncentrációkban teszteltük a szalmonella kolonizációt egerekben: 1 x 103 telepképző egység és 1 x 108 telepképző egység (100 μl/egér) között. 1 x október 6-10 x 108 telepképző egységnél a Salmonella képes volt kolonizálni az egereket. Ezért korábbi 1., 5. publikációink és publikálatlan adatok alapján a Salmonella végső koncentrációja ebben az oldatban nem lesz mérhető a gyomorcsőbe történő etetés előtt.

Ebben a kísérleti eljárásban specifikus kórokozóktól mentes 6-7 hetes C57BL/6 nőstény egerek vannak (Taconic, Hudson, NY). Az alkalmazott baktériumtörzsek közé tartozik a vad típusú Salmonella typhimurium ATCC14028s (WT-SL) törzs, a nem patogén Salmonella mutáns PhoP c3, PhoP c Avra ​​és PhoP c AvrA-/AvrA +, PhoP c Avra ​​(2. táblázat). Ennek a protokollnak az alkalmazásával a Salmonella typhimurium kolonizációja az egér belében több mint 6 hónapig kimutatható (1. ábra). Szalmonella-fertőzés és gyulladás a széklet és a fiúk súlyának megfigyelésével mérve. A szövetminták és a vér összegyűjtésekor a bél hosszát a bélgyulladás jellemzőjeként mérték. A lép és a máj súlyát is megvizsgáltuk. Az egér szérum citokineket ELISA5-vel teszteltük. Ezenkívül biokémiai és molekuláris módszereket alkalmaznak a gyulladásos citokinek és a Salmonella 5 által kiváltott patológiai változások tesztelésére.

Jellemzően a fogyás és a halál a fertőzéstől számított 4 héten belül következik be (1. táblázat). A szalmonella fertőzés után a testtömeg jelentős csökkenése volt megfigyelhető a bakteriális kezelés nélküli kontrollcsoporthoz képest (* pc fertőzött, 78% PhoP c Avra- vagy 70% PhoP c AvrA-/AvrA + fennmaradhat A szalmonellák túlélik a bélben. Az akut fertőzés után az összes túlélő 6 hónappal az ebben a javaslatban leírt eljárás után még mindig szalmonellát hajtott végre, amely a fertőzés után kimutatható volt. Miután az egerek 3 héttel a fertőzés után túléltek, az egerek testtömegre tettek szert és kevesebb haláleset történt Ezenkívül az immunfluroscence festési adatok azt is mutatják, hogy a szalmonella a fertőzés után 27 héttel a bél nyálkahártyájába invazálódik (3. ábra). Ezek az adatok azt mutatták, hogy a PhoP c, a PhoP c Avra ​​vagy a PhoP c AvrA/AvrA + használható a krónikus fertőzés modelljéhez.

Az Nramp1 +/+ gazdarezisztencia-faktorral rendelkező egerek ellenállnak a 3-6. Salmonella-fertőzésnek. Az NRAMP-t tartalmazó C57/BL6 egerek hibásak voltak a jelenlegi vizsgálatokban. Megállapítottuk, hogy a patogén Salmonella 14028-as törzzsel fertőzött egerek 90% -a nem élhet túl 4 héten túl (az adatokat nem közöljük). A vad típusú S hosszú távú hatásainak megértése. Typhimurium fertőzés, Nampr1 +/+ egerek alkalmazhatók.

Ezt a modellt egy BSL-2 laboratóriumban hozták létre. Jegyzőkönyvünket a Rochesteri Egyetem Állati Erőforrások Bizottsága (UCAR) hagyta jóvá. A szalmonellával fertőzött egerek valószínűleg kényelmetlenséget és stresszt tapasztalnak, kevésbé aktívak és lassan mozognak. Szőrük sörtés lehet, és nem engedhetik meg, hogy normálisan táplálják vagy igyák. Az állatokat szorosan figyelemmel kísérjük, és ha bármilyen kellemetlenség jelei vannak, például nem eléggé gyorsak a hidratálás és a kalóriabevitel megőrzéséhez, ha egy egér azt mutatja, hogy felszívódott a folyadék, vagy jelentős súlycsökkenés (10% vagy több) 7, és nem azonnal meghal, az egeret emberségesen megsemmisítették. Minden laboratóriumi személyzetet kiképeznek az egerek megfigyelésére a 8., 9. pont szerint.

A streptomicin előkezelésének számos tanulmánya kihasználta a Salmonella typhimurium által kiváltott vastagbélgyulladást a fertőzés korai fázisának tanulmányozásához. Az egérmodellben azonban csak kevesen számoltak be in vivo krónikus fertőzésről. 11. A GI traktusban tartósan fennálló Salmonella-egerek lehetővé teszik a gazda-baktérium hosszú távú kölcsönhatásának, a szignáltranszdukció és a tumorgenezis feltárását. Hoztunk létre egy krónikus bakteriális fertőzéses egérmodellt, amelynek során Salmonella typhimurium kolonizálódott az egér belében 6 hónap alatt. Ez a modell felhasználható E. coli patogenezis és probiotikumok vizsgálatához is. Összességében ez a protokoll segít az alapvetően fontos egérmodellt kutatóknak megválaszolni a biológiai és mikrobiológiai kérdéseket.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.