RNS izolálás - biológia

Milyen meleg túl meleg az élethez az óceán feneke mélyén?

Antibiotikumok baktériumoktól

Sejtvándorlás: egy ismert fehérje újonnan felfedezett funkciója

Molekuláris iránytű a sejtek igazításához

Mi teszi a levelek öregedését ősszel

A keselyű gyöngytyúk demokráciája

Ekembo környezete: Az emberek nyílt tájakon is éltek

| Genetika | Mezőgazdaság, erdészet és állattenyésztés

A búzafajtát vad füvek keresztezésével hozták létre

Milyen meleg túl meleg az élethez az óceán feneke mélyén?

RNS izolálás

A RNS izolálás a sejtekből lehetővé teszi az aktuális sejtaktivitás elemzését egy bizonyos időpontban, mivel az izolálás pillanatában csak azok a gének állnak rendelkezésre RNS-ként, amelyek jelenleg a sejtben vannak átírva. Így az RNS izolálása fontos technika a molekuláris biológiában, és az izolált RNS számos módszerben felhasználható a génexpresszió elemzésére.

Az RNS kezelésének különlegességei

Az RNázok (olyan enzimek, amelyek katalizálják az RNS hasítását kisebb fragmensekké) rendkívül stabilak és autoklávozás után is aktívak lehetnek. Az RNS nagyon érzékeny az RNázok általi lebontásra, amelynek természetes feladata a foszfodiészter kötések Mg 2+ -független hidrolízise az RNS foszfátvázában. Ezért az RNS kezelése több körültekintést igényel, mint a sokkal stabilabb DNS-sel való munka. Az RNS lebomlásának elkerülése érdekében az RNS-t és az RNázokat korai szakaszban el kell választani egymástól, és meg kell akadályozni az RNázok környezetbe való bejutását a mintába. Ezért eldobható kesztyűt kell viselni, mert az RNázokat minden organizmus termeli, ezért az emberi izzadságban a bőr felszínén is jelen vannak. Ezenkívül ésszerű bizonyos fogyóeszközök (pipetták, pipettadobozok stb.) Felhasználása csak az RNS-kísérletekhez. Ezenkívül speciális RNáz-mentes vizet kell használni.

RNS izolálás

Mint már említettük, az RNS izolálásakor nagyon fontos, hogy az RNázokat a lehető legkorábban elválasszuk az RNS-től. Az RNS izolálásának minden módszere a sejtek olyan kémiai környezetben történő lizálásán alapul, amelyben az RNázok gyorsan denaturálódnak. Ezután az RNS-t elválasztjuk a többi sejtkomponenstől. Ily módon teljes RNS-t kapunk. Ez a teljes RNS vagy közvetlenül felhasználható további kísérletekhez (pl. Northern blot, reverz transzkripció cDNS-ben), vagy kiindulási anyagként használható az mRNS izolálásához.

izolálás

Chomczynski és Sacchi módszer

Ez a módszer speciális reagenseket használ (pl. TRIzol Reagent ® az Invitrogen-től vagy TriFast ™ a peqLab-tól). Ez lehetővé teszi RNS megszerzését sejtekből vagy szövetekből egy meghatározott protokoll szerint. Ez az eljárás az ún "Egylépéses" Chomczynski és Sacchi szerinti módszer. A Trizol guanidinium-tiocianátot tartalmaz, amely lizálja a sejteket, ugyanakkor inaktiválja az RNázokat és más enzimeket. A reagens fenolt is tartalmaz, amelyben a DNS és a fehérjék feloldódnak. A fázisokat kloroform hozzáadásával szétválasztjuk, majd centrifugáljuk. Ezután három fázist lehet felismerni. A felső vizes fázis RNS-t, az interfázisú DNS-t és az alsó kloroformfázisú fehérjéket tartalmaz. A vizes fázisban lévő RNS-t ezután izopropanollal vagy etanollal kicsapjuk. Két mosási lépés után az RNS-t feloldjuk például RNáz-mentes vízben, és további alkalmazásokhoz rendelkezésre áll.

"Nonidet P-40" módszer

Ez a módszer nem alkalmas szövetek számára, és arra használják, hogy mRNS-t nyerjenek a citoszolból. A módszer előnye, hogy a sejtmagok érintetlenek maradnak, és így lehetőség van a DNS izolálására is. Az elv a nemionos Nonidet P-40 detergensen alapul, amelyet hozzáadnak a sejtekhez, és a DNS (sejtmag) centrifugálás után üledékként ül le. Az RNS, a fehérjék és a sejttörmelék oldatban maradnak. Ezután következik, mint a "Egylépéses" A módszer elkülönítése fenol/kloroform eleggyel.

Kit rendszerek

Az RNS izolálásának további lehetőségeként számos készletet kaphatunk különböző vállalatoktól és számos kivitelben (pl. RNeasy Mini Kit ® a Qiagen-től). Ezek a kit rendszerek kis oszlopokat használnak, amelyek specifikusan megkötik az RNS-t.

A koncentráció meghatározása spektrofotometriával

A koncentráció spektrofotometriás meghatározásakor az optikai sűrűséget megmérjük λ = 260 nm-nél (OD260), a nukleinsavak abszorpciós maximumán (DNS, RNS) és λ = 280 nm-nél (OD280), a fehérjék abszorpciós maximumán. Hogy a minta szennyezett-e genomi DNS-sel vagy fehérjékkel, az OD260 és OD280 hányadosa alapján határozható meg. A tiszta RNS esetében az aránynak 2,0 körül kell lennie. Ha az érték ennél alacsonyabb, a minta fehérjével, genomi DNS-sel és/vagy aromás anyagokkal szennyeződik. Ebben az esetben az RNS-t újra meg kell tisztítani. Mivel az 1 OD260 értéke 40 µg/ml RNS-nek felel meg, az RNS-koncentrációt a következő képlet segítségével lehet kiszámítani:

Koncentráció [µg/ml] = OD260 × 40 µg/ml × hígítási tényező