2D gélelektroforézis - biológia

A kétdimenziós gélelektroforézis vagy 2D gélelektroforézis analitikai módszer a biokémiában, a molekuláris biológiában és a proteomikában. O'Farrell [1] és Klose [2] fejlesztette ki 1975-ben, egymástól függetlenül. Kombinálja az izoelektromos fókuszálást (IEF) SDS poliakrilamid gélelektroforézissel (SDS-PAGE), hogy a komplex fehérje-keverékeket (bakteriális lizátumok, magasabb sejtekből vagy szövetekből származó lizátumok, testnedvek) különálló fehérjékké különítsék el. Különösen nagy felbontású elválasztás érhető el a két ortogonális elválasztási technika kombinációjával.

A fehérjemintázat minden foltja megfelel egy fehérjemolekula típusának (fajának). Mivel a biológiai rendszerek fehérje mintázata a környezettől és az állapottól függően változik, felhasználhatók sérült és egészséges vagy optimálisan és szuboptimálisan megnövekedett sejtek megkülönböztetésére. Például információt nyújtanak a betegség okairól vagy a gyógyszerek hatásmechanizmusáról molekuláris szinten. A kétdimenziós fehérjeminták összetettsége miatt speciálisan kifejlesztett számítógépes programokat használnak értékelésükhöz.

A minta előkészítése

A mintát a lehető legmegegyezőbb körülmények között nyerjük és dolgozzuk fel. Ez kizárja annak lehetőségét, hogy a vizsgálandó kísérleti változók mellett hamisító hatások hatjanak a mintára. A fehérjék általában extracelluláris élőhelyekből (szekretált fehérjék) csapódnak ki. Az intracelluláris fehérjéket a sejtstruktúrák kíméletes roncsolásával extrahálják. Természetes környezetükön kívül a fehérjék különösen érzékenyek az aggregátumok képződésére és a proteázok általi lebontásra. Ezenkívül a minta előkészítése 0 ° C közelében működik. Általános szabályként karbamidot és nemionos detergenseket, valamint proteázgátló anyagokat adnak a kölcsönhatások és a fehérjében bekövetkező változások elkerülése érdekében.

Első dimenzió (IEF)

Az IEF (első dimenzió) során a fehérje-kivonatot pH-gradiens gélben egydimenziósan elválasztjuk elektromos mezőben. A fehérjék savas és bázikus aminosavmaradékai a környezeti pH-értéktől függően különböző (de) protonációs állapotokon mennek keresztül, és így meghatározzák a fehérje töltését. Ezért felelősek az elektromos mező fehérjékre gyakorolt hatásáért. Az izoelektromos ponton (pI) a fehérje pozitív és negatív töltései kioltják egymást. A pl megfelel annak a pH-nak, amelynél a fehérje nettó töltése nulla. Az elektromos mező már nem hat erőként a most töltéssemleges fehérjére, és a fehérje lerakódik. A diffúzió okozta változás a szomszédos pH-tartományokban a fehérje megújult elektromos töltéséhez vezet. Viszont az új hatású elektromos mező azonnal elősegíti a fehérjét annak izoelektromos pontjáig. Két különböző IEF technológia áll rendelkezésre.

Immobilizált pH-gradiensek (IPG): A gélcsík poliakrilamid-mátrixból áll. A gélcsík egyik vége olyan akrilamid-származékokat tartalmaz, amelyekben a mátrixban savas oldalláncok vannak, a másik oldalon pedig alkáli funkciós csoportok találhatók. A semleges akrilamid és a gradiensben hozzáadott savas és lúgos származékok kopolimerizációja változatlan, mozdulatlan pH-gradienst eredményez.
pH-gradiensek a hordozó amfolitok alapján: A hordozó amfolitok szintetikus aminosavak, és szabadon mozgathatók gélcsíkban vagy hosszú hengeres gélben (általában csőben). Ha elektromos mezőt alkalmazunk, akkor pH-gradienst képeznek, amely azonban idővel instabil. Az idő növekedésével a gradienst meghatározó töltéshordozók a gél végére vándorolnak, és előbb-utóbb deformálják a menetét.

Kiegyenlítés

Az úgynevezett egyensúlyi eljárás során, amely a pI utáni elválasztást követi, a fehérjékkel rendelkező gél kezdetben redukálódik (például merkaptoetanollal vagy ditiotreitollal). Ez a diszulfid hidak eltávolítását szolgálja. A keletkező -SH HS-csoportok diszulfid- (-S-S-) csoportokká történő oxidációjának megakadályozása érdekében a HS-csoportok z-k. B. jód-acetamiddal alkilezett. Végül a fehérjéket nátrium-dodecil-szulfáttal (SDS) töltjük fel. Az SDS negatív töltésű mosószer. Három aminosav esetén körülbelül egy SDS molekula kötődik a fehérje molekulához alifás végén keresztül hidrofób kölcsönhatáson keresztül. A negatív töltésű oldallal taszítja magát a megkötött SDS-molekulák közelében lévő töltött végektől. Ez a fehérjemolekulák teljes kibontakozásához (linearizációjához) vezet. Minél nagyobb egy fehérjemolekula, annál hosszabb ideig alakulnak ki a kapott láncok SDS-sel. Mivel a fehérje hosszától függően számos negatív töltésű SDS molekula kötődik, a belső töltés a legtöbb fehérje számára elhanyagolható.

Második dimenzió (SDS-PAGE)

A pH-érték szerint elválasztott és kiegyensúlyozott fehérjéket tartalmazó gélcsíkot egy négyzet alakú vagy téglalap alakú poliakrilamid-gél szélére helyezzük, amely szintén SDS-t tartalmaz, és a fehérjéket a második elektroforézis során az első dimenzióra merőlegesen méretük szerint választjuk el. Az elektromos mező alkalmazásakor (az IEF gélcsíkkal szemközti anód) az SDS-rel körülvett kibontakozott fehérjék a negatív töltésfeleslegükkel a gélen keresztül vándorolnak, ami a fehérjéknek nagyobb vagy kisebb ellenállást kínál a molekulaméretüknek megfelelően. A kis molekulák viszonylag zavartalanul vándorolnak, és gyorsan elérik a gél szélét az IEF géltől elfelé nézve, míg a nagy molekulákat a gél folyamatosan lassítja, miközben vándorolnak, és alig haladnak előre. A szétválasztás a második dimenzióban akkor áll le, amikor a kis fehérjék megérkeznek a gél pereméhez, amely az IEF gél felé néz. Ezt láthatóvá teszi egy kísérő festék, például a bróm-fenol-kék. Annak érdekében, hogy a fehérje mintázat az elválasztás után is megmaradjon, azt egy utolsó lépésben rögzíteni kell. Ehhez metanolt és ecetsavat használnak. Ezek denaturálják az elválasztott fehérjéket és összekapcsolják a gélmátrixszal. Ez megakadályozza a diffúziót, és a 2D minta stabil az idő múlásával.