A cink és a lipid ülepítésének hatása a 2,2-enoil-CoA izomerázra és a kiválasztott jellemzőkre
1 A cink és a lipid ülepedés hatása a 3, 2-enoil-CoA izomerázra és a növekvő patkányok lipid-anyagcseréjének egyes jellemzőire Jennifer Justus Kezdeményezés a doktori cím megszerzéséhez (Dr. oec. Troph.) A Justus Agrártudományi, Ökotrofológiai és Környezetgazdálkodási Karán Liebig University Giessen
3 A Justie Liebig Egyetem Állat-táplálkozási és Táplálkozási Élettani Intézetétől Gießenben A cink- és lipid-ülepítés hatása Δ 3, Δ 2 -enoil-CoA izomerázra és a lipid-anyagcsere kiválasztott jellemzőire növekvő patkányokban Első értekezés a doktori fokozat megszerzéséhez . troph.) a 09-es Karon - a Justus Liebig University Giessen agrártudományi, ökotrofológiai és környezetgazdálkodási intézete, diplom. oec. trófea. Jennifer Justus Giessen 2007
4 Értekezés a Gießeni Justus Liebig Egyetem Agrártudományi, Táplálkozástudományi és Környezetgazdálkodási Karán Dean: Prof. Dr. R. Herrmann vizsgabizottság: elnök: Prof. Dr. Hoffmann I. 1. bíráló: Prof. Dr. E. Weigand 2. bíráló: Prof. Dr. J. Pallauf vizsgáztató: Prof. Dr. H. Brückner vizsgáztató: PD Dr. S. Rudloff vitás napja: 2007. január 22
5 Tartalomjegyzék I Tartalomjegyzék Ábra lista. IV Az áttekintések listája. V Melléklet táblázatok és ábrák felsorolása. VII A rövidítések listája. IX 1 Bevezetés Cinkhiány és hatása a lipidanyagcserére A nyomelem cink Cinkhiány A cink biológiai funkciói Cink anyagcsere és a cink állapot meghatározása A génexpresszió szabályozása cinkkel A lipid anyagcsere és a telítetlen zsírsavak specifikus anyagcseréjének változásai A lipid anyagcseréjének változásai cink hiányban Telítetlen zsírsavak lebomlása és Δ 3, Δ 2 funkciója -Enoyl- CoA izomeráz Telítetlen zsírsavak expresszió-modulációs potenciálja Kísérleti rész Kérdés A kísérlet leírása A kísérleti étrendek összetétele Az elemzési anyag megszerzése és feldolgozása Analitikai módszerek Hemoglobin, hematokrit A széklet zsírtartalma A cink állapotának meghatározása Fehérje koncentrációk A Δ 3, Δ 2 -Enoyl-szubsztrát termelésének aktivitása A mitokondriális Δ3, Δ2-enoil-CoA izomeráz assay szukcinát-dehidrogenáz assay génexpressziós analízis kinyerése a teljes RNS extrakciója. 37
6 II Tartalom-jegyzék RT-PCR agaróz gél elektroforézis és az optikai sűrűségek értékelése Lipidprofil Plazma lipidek Máj lipidprofil A máj lipidfrakcióinak zsírsavmintája Keton testek a plazmában és a vizeletben 2-enoil-CoA izomeráz mrna-expressziója a Δ 3, Δ 2 -enoil-CoA izomeráz és a PPAR alfa- és gamma plazma lipidjei máj lipidfrakcióinak májzsírsav-frakciói lipidfrakciók keton testek Megbeszélés Megjegyzés az állati modellről A tesztállatok növekedési és cinkállapota A cink és a lipid ülepítésének hatása a Δ 3, Δ 2 -enoil-CoA izomeráz aktivitására és expressziójára A PPARalpha, a PPARgamma és a keton testkoncentrációjának hatása Hatás a plazma és a máj lipidprofiljára Cink hatása - és lipidüledékképződés a máj összes lipidjeinek, trigliceridjeinek és foszfolipidjeinek zsírsavmintájára Következtetés Összefoglaló Irodalomjegyzék Melléklet 106.
7 Tartalomjegyzék III Összefoglaló absztrakt magyarázat. 136
10 VI Tartalomjegyzék Áttekintés 23: Áttekintés 24: Áttekintés 25: Áttekintés 26: Áttekintés 27: Relatív összes lipid-, koleszterin-, triglicerid- és foszfolipidtartalom a májban (mg/100 g élősúly). 59 zsírsav a máj összes lipidjéből (g/100g összes zsírsav). 61 zsírsav a máj összes lipidjéből (mg/g máj FM). A máj triglicerid-frakciójának 64 zsírsavja (g/100 g összes zsírsav). A máj foszfolipid frakciójának 66 zsírsavja (g/100 g összes zsírsav). 67
12 VIII Tartalom-jegyzék A 23. táblázat: A 24. táblázat: 3-hidroxi-butirát koncentráció a plazmában és a vizeletben a gyűjtési időszakban FS-metil-észter a FAME C4-C24 keverékben (18919, Sigma) A 25. táblázat: LCQ-adatok A 1. ábra: Molekulaszerkezet és a transz-3-hexenoil-kaka molekulatömege A2. ábra: A tisztított transz-3-hexenoil-kaka tömegspektruma, a fenti pozitív mód, az alatta negatív mód. A 3. ábra: A 3-HB autóskészlet protokollja (Wako Chemicals). 132
13 Tartalom IX Rövidítések listája 3-HB 3-hidroxi-butirát AI Megfelelő bevitel ALA alfa-linolénsav AP Lúgos foszfatáz BHT Butilhidroxiltoluol BSA Szarvasmarha szérum albumin Kol koleszterin CoA Koenzim A CRIP ciszteinben gazdag bélfehérje d nap DCIP 2,6-diklórTen1 1 (szintén Nramp2) DEPC dietilpirokarbonát DHA dokozahexaénsav DRI Diétás referencia bevitel DTNB 5,5 -Ditiobisz (2-nitrobenzoesav) ECI Δ 3, Δ 2 -enoil-CoA izomeráz EPA eikozapentaénsav f hígítási faktor FAME zsírsav FID zsírsav metilészter FID -3-foszfát-dehidrogenáz GC gázkromatográfia GFS telített zsírsavak (kakaóvaj-diéta) GL összes lipid Hb hemoglobin Hk hematokrit HNF-4 máj magfaktor-4 hzip4 humán zrt-, irt-szerű fehérje 4 hztl1 humán ZnT-szerű transzporter 1 ICP-AES Induktívan kapcsolt plazma atomemissziós spektrométer IS belső standard LM oldószer M Átlag
14 X Tartalomjegyzék MFE1 multifunkcionális enzim 1 perc MRE Metal Response Elem MT metallotionein MTF1 MRE-kötő transzkripciós faktor-1 MUFS többszörösen telítetlen zsírsav n.n. nem detektálható, mennyiség a kimutatási határ alatt ns nem szignifikáns p A hiba valószínűsége PC foszfatidilkolin PCR polimeráz láncreakció PL foszfolipid PP peroxiszóma proliferátor PPAR peroxiszóma proliferátor által aktivált receptor PPRE PPAR válasz elem RDA ajánlott étrendi ráfordítás RT fordított transzkriptáz RXR SDHrogen standard eltérés X Receptdehyde Acc SREBP-1 szterin szabályozó elem megkötő fehérje-1 T a TAE TG T m TM TMSH izzítási hőmérséklet Trisz-acetát-EDTA-puffer triglicerid Olvadáspont Szárazanyag N-Trimetil-szulfónium-hidroxid U Enzimaktivitás (egység, szubsztrátforgalom µmol perc -1) UFS telítetlen Zsírsavak (pórsáfrányolaj-étrend) UL tolerálható felső beviteli szint v térfogat lásd összehasonlítást a w tömeggel szemben Zn cink ZnT-1 cink transzporter-1
19 Szakirodalmi áttekintés 5 ligandum kötött: három aminosavhoz (His, Glu, Asp vagy Cys) és egy vízmolekulához. A cinket három His rögzíti a szénsav-anhidrázban, és a His-Glu-His a karboxipeptidázban (VALLEE és AULD 1990, MCCALL és mtsai. 2000); a cink hiánya a katalitikus aktivitás elvesztéséhez vezet. Szerkezeti komponensként a cink tetraéderesen kötődik négy aminosavhoz (Cys vagy His), és befolyásolja az enzim lokális konformációját és stabilitását (1. A. ábra). AB 1. ábra: A cink-struktúrák (A) a cink-metalloenzimekben, (B) a transzkripciós faktorok DNS-kötő doménjeiben (VALLEE és AULD 1992 szerint) A cink meghatározza a cink-ujj, a cink-klaszter és a cink-rotációs fehérjék háromdimenziós szerkezetét is, a cink-tartalmú transzkripciós faktorok csoportját ( 1. ábra B). A cinkujjfehérjék az eukarióta genomban a leggyakoribb fehérjék közé tartoznak, amelyek háromdimenziós konformációjuk miatt közvetlenül kölcsönhatásba léphetnek a DNS-sel. A transzkripciós szabályozásban rejlő sokféle funkciójuk egy része még tisztázásra kerül (LAITY et al. 2001). Cys 2 His 2 és Cys 3 cink ujjai különböző mechanizmusokon keresztül képesek felismerni specifikus RNS szekvenciákat és hozzájuk kötődni (HALL 2005).
24 10 Irodalmi áttekintés 2.2 A gén expressziójának cink általi szabályozása A cink katalitikus és strukturális, valamint szabályozó funkciója egyaránt összefügg a génexpresszióra gyakorolt hatással (VALLEE és FALCHUK 1993, COUSINS 1998, DREOSTI 2001). A transzkripció lényeges lépéseként az RNS szintézise az RNS polimerázok katalitikus aktivitása révén megy végbe, amelyekhez metalloenzimekként két cinkatomra van szükség. A cink szerkezeti funkciójának fontosságát a legimpozánsabban a cinkujj motívumok tárják fel: A hurok alakú ujjszerkezet akkor jön létre, amikor egy cinkatomot tetraéderesen bonyolítanak a peptidlánc ciszteinil- vagy hisztidilcsoportjai (1. B ábra). A DNS-sel való kölcsönhatás előfeltétele. Új számítások szerint az emberi proteóm 10% -a potenciálisan cinkkötő fehérje (ANDREINI et al. 2006), amelyek közül a legtöbben a cinkujjak, amelyek többsége transzkripciós faktorként funkcionál. Cinkre reagáló gének fiziológiai moduláció közvetlen szabályozás szekunder mediátorok szabályozták transzkripcióval szabályozott transzkripciós mrnas fehérjék 3. ábra: A cink lehetséges szintjei a génexpresszióra (COUSINS 1998 után)
58 44 Kísérleti rész, 14. áttekintés: GC paraméterek és hőmérsékleti programok az FS minta meghatározásához Detektálás: FID üzemanyaggázok: H 2 (35 ccm/min) szintetikus levegő (250 ccm/min) smink gáz N 2 (25 ccm/min) Automatikus mintavevő: 910-es típusú Chrompack injekció: Osztott térfogat: 1 µl Inlay: Üveg harang alja Vivőgáz: H 2 összes lipid kivonat: Splitflow: 25 ccm/min Vivőgáz előnyomás: 80 kpa Hőmérsékleti program: 200 C, 2 C/perc - 220 C 220 C 45 min triglicerid-eluátum: osztott áramlás: 20 ccm/perc vivőgáz bejutási nyomás: 60 kpa hőmérsékleti program: 220 C 23 perc 2 C/perc 230 C-on 230 C 35 perc foszfolipid-eluátum: osztott áramlás: 15 ccm/perc vivőgáz bejutási nyomás: 55 kpa Hőmérsékleti program: 220 C 20 perc 4 C/perc - 235 C 235 C 25 perc
59. kísérleti rész 45. A FAME-standard helyreállítási arányát rendszeresen (2-3 minta után) ellenőriztük, és mintánként legalább három GC-futtatást alkalmaztunk az értékeléshez. Az elemzésbe nem vettek bele olyan csúcsokat, amelyeket egyetlen FS-hez sem lehetett hozzárendelni. A mennyiségi meghatározás határértéke az összes zsírsav 0,05% és 0,2% (w/w) között volt, az egyedi FA-tól és az extraktum lipidtartalmától függően. A FAME-standard kromatogramját a 7. ábra mutatja. A FAME-k teljes nevét a függelék tartalmazza. 7. ábra: A FAME-Mix C4-C keton testek GC kromatogramja a plazmában és a vizeletben A 3-hidroxi-butirát (3-HB) koncentrációját a plazmában és a vizeletben a 3-HB autokit (Wako Chemicals) segítségével határoztuk meg. A meghatározási protokoll a függelékben található. 8 µl plazmát vagy 20 µl vizeletet és a vakérték meghatározásához aqua bidest használtunk. A 3-HB standardot (Ketone Body Calibrator 300) a minta térfogatának megfelelően hígítottuk. A plazmában és a vizeletben lévő 3-HB koncentrációt csoportonként öt állatban kétszer határoztuk meg.