A C-vitamin-módszer optimalizálásának HPLC-elemzése és referenciaérték-létrehozása - PDF ingyenes
A Schleswig-Holstein Egyetem Orvosi Központjának Lübeck Campus Központi Laboratóriumából vezető: Prof. Dr. med . Seyfarth és a Lübecki Egyetem orvosi karának dékánja: Prof. Dr. Med. Solbach HPLC elemzése a C-vitaminnal: módszer optimalizálás és referenciaérték-létrehozás. Nyitó disszertáció doktori cím megszerzéséhez a Lübecki Egyetemen - az orvosi karon - Cornelia arlene Focke, Bréma Lübeck 2010 1
1. Előadó: Prof. Dr. med. ichael Seyfarth 2. előadó: Priv.-Doz. Dr. med. Gunther Eitz Szóbeli vizsga napja: 2010.06.09. Nyomtatásra jóváhagyva. Lübeck, 2010. szeptember 6. aláírta Prof. Dr. med. erner Solbach - az orvosi kar dékánja 2
egyél, ami mérhető. (Galileo Galilei) 3
2.2.8 A minták stabilitásának vizsgálata. 31 2.2.9 Optimalizált HPLC módszerek az aszkorbinsav meghatározására a szérumban és a plazmában. 32 2.2.10 A vizelet és a likőr C-vitamin vizsgálata. 32 2.3 A módszer validálása. 33 2.3.1 A helyesség vizsgálata. 33 2.3.2 Precíziós vizsgálatok. 33 2.3.3. A kimutatási és mennyiségi határértékek vizsgálata. 34 2.3.4 Vizsgálatok a mérés linearitására. 34 2.4 A módszerek alkalmazása: referenciaértékek meghatározása és a C-vitamin kinetikájának vizsgálata. 34 2.4.1 Referenciaértékek. 34 2.4.2 Kinetika. 35 2.5 Statisztikai módszerek. 35 3. Eredmények. 37 3.1 módszer optimalizálás és validálás. 37 3.1.1 Helyhez kötött fázis. 37 3.1.2 Obile fázis. 37 3.1.3 Belső standard. 40 3.1.4 Helyesség. 40 3.1.5 Pontosság. 41 3.1.6 Kimutatási határ. 41 3.1.7 Lineáris étkező. 42 3.1.8 A C-vitamin minták stabilitása. 42 3.1.9 Vizelet- és CSF-minták mérése. 46 3.2 A módszerek alkalmazása. 47 3.2.1. A referenciaérték meghatározása. 47 3.2.1.1. Korspecifikus különbségek vizsgálata. 49 3.2.1.2. A nemekre jellemző különbségek vizsgálata. 51 3.2.2 C-vitamin kinetika. 53 4. Megbeszélés. 56 4.1 módszer optimalizálás. 56 4.2 A módszer határai. 58 4.3 Referenciaértékek. 58 4.4 Kinetika. 59 4.5 Lehetséges felhasználások. 60 4.6 Kitekintés. 60 5
5. Összefoglalás. 61 6. Függelék. 62 Irodalomjegyzék. 67 Köszönetnyilvánítás. 80 önéletrajz. 81 Függetlenségi nyilatkozat és alkalmazásnyilatkozat. 82 6
Rövidítések listája ábra ábra Aqua desztillált víz d nap ECD elektrokémiai detektálás EDTA Etilén-diamin-tetraecetsav HPLC nagy teljesítményű folyadékkromatográfia I.U. nemzetközi egységek i.v. intravénás kg kg kg testtömeg l liter LDL alacsony sűrűségű lipoprotein mg illigramm min inute ml illiliter µmol ikromol mmol illimol PA metafoszforsav na nanoampère no. A perifériás artériás okkluzív betegség pavk száma PCA perklórsav rp HPLC fordított fázisú HPLC RT szobahőmérséklet, lásd az SD szórás fülét.
Ezenkívül egy olyan interfészen keresztül, amely lehetővé teszi a rendszer vezérlését és a mérési adatok számítógépes rögzítését és kiértékelését. 5. ábra: HPLC rendszer ábrázolása mozgófázissal (oldószer), szivattyúval, befecskendező rendszerrel (injektor), oszloppal (HPLC oszlop), detektorral (detektor), hulladékkal (aste) és csatlakoztatott számítógéppel az adatok kiértékeléséhez (adatok) ( http://www.chemistry.nmsu.edu/instrumentation/aters_hplcsystem.gif). Mivel a vegyületeket a szilárd fázisban különböző ideig (retenciós idő) tartják fenn, az anyagok azonosíthatók, azaz kvalitatív elemzés lehetséges. A kromatogramon a detektorjel (y-tengely) grafikus ábrázolása az idővel (x-tengely), az elhajlás, az úgynevezett csúcs magassága szintén lehetővé teszi a koncentráció meghatározását, azaz kvantitatív elemzést a magasság vagy a terület kiszámításán keresztül. 6. ábra: Példa kromatogramra. Az elhajlás mértékét (y tengely) ábrázoljuk az idővel (x tengely) (retenciós idő). A és B két különböző magasságú csúcsot mutat. 20
A minták stabilitásának szisztematikus vizsgálata különböző közegekben Referenciaértékek létrehozása különböző korcsoportok számára C-vitamin kinetika vizsgálata egészséges önkénteseken Ezen felül ellenőrizni kell, hogy az optimalizált módszer alapvetően alkalmas-e más biológiai folyadékokban, különösen vizeletben lévő C-vitamin meghatározására is és a cerebrospinalis folyadék. 26-án
2. Anyag és módszerek 2.1 Berendezések, vizsgálati anyagok, vegyszerek 2.1.1 Felszerelés HPLC rendszer: L-6220 Intelligens szivattyú (erck Hitachi) D-6000A interfész (erck Hitachi) AS-2000A autosampler (erck Hitachi) Degasser (Knauer) L- 4250 UV-VIS detektor (erck Hitachi) Amperometrikus detektor L-3500A (erck recept) HPLC oszlop és védőoszlop: Synergi 4 µm Hydro-RP 80A 150 x 4,6 mm (Phenomenex 00F-4375-E0) SecurityGuard őrpatronkészlet, AQ -C18 patron 4 x 3,0 mm (Phenomenex AJ0-7511) HPLC szoftver: odel D-7000 Chromatography Data Station szoftver HPLC rendszer anager (erck) Szűrőrendszer: Vákuumszűrő készülék (illipore) Cellulóz-acetát szűrő 0,2 µm pórusméret ( Sartorius AG 11107-47-N) Egyéb eszközök: ph-éter (ettler Delta 345) Vortex ischer aage (ettler Toledo Ag 241) ultrahangos fürdő 2.1.2 Szérumok, plazmák, folyadék és vizelet Szérumok és plazmák: A módszer fejlesztéséhez és validálásához Maradék szérumok és plazmák, vizeletek és folyadékok az U központi laboratóriumának rutinvizsgálatából egyetemi kórház 27