A DNS-kópiaszám-variációk (CNV) genomszintű molekuláris genetikai vizsgálata
Az Orvostudományi Kar Neuropatológiai Intézetétől Charité Universitätsmedizin Berlin ÉRTEKEZÉS ÉRTEKEZÉS A DNS-kópiaszám-variációk (CNV-k) genomszintű molekuláris genetikai vizsgálata kolangiocelluláris karcinómákban a doktori fokozat megszerzéséhez Doctor medicinae (Dr. med.) Ramenskoye doktori címe: 2016.09.09
1-1. Ábra A kolangiocarcinoma altípusainak osztályozása intrahepatikus és extrahepatikus (perihilaris és distalis) anatómiai elhelyezkedés alapján az UICC besorolás szerint. Módosítva: Blechacz és mtsai, 2011 (10) 1.3. A kolangiokarcinóma epidemiológiája A kolangiocelluláris karcinóma előfordulása, amely az összes gyomor-bél daganat 3% -át képviseli, világszerte növekszik (12, 13). Az előfordulás azonban országonként nagyon eltérő, Nyugat-Európában 1-2/100 000, Délkelet-Ázsiában pedig akár százszor magasabb is (14). Különböző helyi kockázati tényezők és genetikai állapotok felelősek ezért az eltérésért (15). Mind az intra-, mind az extrahepatikus cholangiocarcinomában a férfiak világszerte gyakrabban érintettek, mint a nők, 1,5 (14) arányban. Mindkét altípusban az érintettek többsége 65 évnél idősebb a diagnózis felállításakor (16). A betegek azonban nagyobb arányban fordulnak elő országokban (Délkelet-Ázsia) 7
1-2. Ábra Az intrahepatikus kolangiokarcinómák makroszkopikus osztályozása a japán májrák vizsgálati csoport (LCSGJ) szerint. Blechazc és mtsai, 2011 (10) Az extrahepatikus cholangiocarcinomák esetében ismét különbséget tesznek egy exofita és intraduktális növekedési mintázat között (42), mindkét típus perineurális invázióval és a nyirokcsomók érintettségével jár (10 A kolangiokarcinómák szövettani osztályozásához a WHO osztályozás mellett létezik az AJCC/UICC jelenlegi kiadása, amely az adenokarcinómákat írja le a leggyakoribb formának, valamint a ritkább formákat (adenozvamagos és pikkelyes karcinómák, mucinózus, pecsétgyűrűs sejtszerű, szarkómás, limfoepitheliomatózus és 43, 44). A kolangiocelluláris karcinóma leggyakoribb formája a közepesen vagy jól differenciált adenokarcinoma, amelyet mirigyes vagy tubuláris szerkezet jellemez. Itt a köbméteres vagy oszlopos anaplasztikusan megváltoztatott hámsejtek eozinofil citoplazmát mutatnak, kerek központi sejtmaggal. A heterogén tumorsejtek gyakran az epevezeték és az ideghüvely falai mentén terjednek (45). 11.
A kolangiokarcinóma farmakológiai terápiájához 2010-ig nem volt szabványosított kemoterápia, az adatok hiánya miatt. A gyakran alkalmazott gemcitabin monoterápia csak nem kielégítő eredményeket hozott (98). Az angliai NCRI ABC-01 és ABC-02 vizsgálatokkal azonban potenciálisan trend-beállító terápiát hoztak létre, amely gemcitabint és cisplatint tartalmaz az epevezeték nem reszekálható daganatai számára (99, 100). Ezeknek a tanulmányoknak az eredményeit egy hasonló, Japánban végzett tanulmány is megerősítheti (101). A monoklonális antitestek, amelyek kifejezetten beavatkoznak a molekuláris folyamatokba, szintén új terápiás megközelítések (102). Jelenlegi kiindulópontjaikat és újabb kutatási eredményeiket a vita részben tovább vizsgáljuk. 19-én
3 Anyag és módszer 3.1 Betegek és daganatminták Az egyedi vizsgálatokhoz különböző daganatminták voltak rendelkezésre, amelyeket részletesen bemutatunk. 1. A molekuláris inverziós szonda (MIP), az immunhisztokémia és a fluoreszcencia-in-situ hibridizáció (FISH) segítségével történő elemzéshez 24 paraffinba ágyazott formalin-fixált tumormintát (FFPE) használtunk a Charité - Universitätsmedizin Berlin levéltárából. Az összes mintát meghatároztuk a MIP és az immunhisztokémiai vizsgálathoz, valamint 20 kiválasztott mintát a FISH elemzéshez (3-1. Táblázat). 3-1. Táblázat: FFPE tumor populáció. 21.
2. Az RT-PCR alkalmazásával végzett vizsgálathoz a Charité - Universitätsmedizin Berlin (Általános, Visceralis és Transzplantációs Sebészeti Klinika archívumából) 30 krio-tartósított daganatmintát, amelyeket műtéti eltávolítást követően sokkban fagyasztottunk folyékony nitrogénben és -80 C-on tároltunk. 3-2. Táblázat). Ez a csoport csak az intrahepatikus cholangiocarcinomákat foglalja magában. 3-2. Táblázat: Cryoasservated tumor populáció. 22-én
A modern multiplex technológiának köszönhetően több mint 20 000 MIP futhat végig a folyamaton egyetlen megközelítéssel, és így elemezhető. 3-2. Ábra A MIP megközelítés reakciószekvenciája: (1) A MIP kötése a genomi DNS-hez (2) Hézagkitöltés polimerizációval (3) A MIP homológ végeinek ligálása (4) Az exonukleáz eltávolítja a nem reagált mintákat (5) A minta felszabadulása (6) ) A MIP amplifikálása PCR alkalmazásával. Módosítva: Hardenbol et al., 2003 (105) 26
3-3. Ábra A MIP munkafolyamatának összefoglalása. Módosítva Hardenbol és munkatársai, 2003 (105) szerint. Anyag és oldatok: A MIP vizsgálat elvégzéséhez a korábban kivont genomi tumor DNS 75 ng-ját vizes oldatba helyeztük. Végrehajtás: Hibridizáció az OncoScan TM FFPE Express 2.0 tömbön. A Molecular Inversion Probe módszert Affymetrix (Santa Clara, USA) végezte. 3.5 A másolatszám-adatok elemzése a Nexus Copy Number szoftver segítségével A MIP tömb minden mintája meghatározza a genom mentén egy lokalizációt, amelyet a MIP-ek fluoreszcencia-intenzitása határoz meg. akarat. A jelintenzitás átalakítását kópiaszám-változásokká szegmentációnak nevezzük. A Nexus szoftver által használt SNP-FASST2 algoritmus a kísérlet tömbjének intenzitását egy belső kontrollhoz kapcsolja, és ezt átalakítja a logaritmus használatával a 2. bázisra (log2). Ebben az esetben csak nem tumoros minták vannak csoportosítva kontrollként, amelyek ezután referenciajelként szolgálnak, amellyel az egyes tumormintákat lépésről lépésre összehasonlítják. Ennek megfelelően egy törlés eredményez egy 27 SNP adott helyét
alacsonyabb jelintenzitással, mint a referencia, míg egy erősítés megnövekedett jelhez vezet (3-4. ábra). 3-4. Ábra A MIP jelintenzitásának a kromoszóma mentén történő elhelyezésének sematikus ábrázolása. Nexus másolatszám kézikönyv (NEXUS MÁSOLATSZÁM, Biodiscovery, Hawthorne, USA) Minden minta esetében ezek a log2 értékek az x tengelyen, mint minta helyén, az y tengelyen pedig a logaritmus arány értékeként jelennek meg (3-5. Ábra). 3-5. Ábra Példa egy kísérlet eredményeire és annak ábrázolása grafikonként a genom mentén. Nexus másolatszám-kézikönyv (NEXUS MÁSOLATSZÁM, Biodiscovery, Hawthorne, USA) 28
3-6. Ábra A B allél frekvencia sematikus ábrázolása. Nexus másolatszám-kézikönyv (NEXUS MÁSOLATSZÁM, Biodiscovery, Hawthorne, USA) A másolatszám-állapotra és az allélarányra vonatkozó információk lehetővé teszik a szoftver számára az intenzitásjelek behívását. Az alábbi 3-3. Táblázat elmagyarázza a jelek értelmezésének módját. Egyetlen vagy több példányszámú nyerés esetén az allél-egyensúlyhiány várható az allélfrekvencia-diagramban. A nyereség ritkán lehet olyan erős, hogy szinte kiszorítja a másik allél jelenlétét, így megjelenik egy LOH képe. Az allél másolatának elvesztése LOH-ként fog megmutatkozni, míg egy homozigóta veszteség teljes allélvesztésként jelenik meg. A változatlan példányszám és az LOH kombinációja az allél frekvenciaábrájában egy másolat semleges LOH-t jelez. Ez a folyamat, más néven uniparentális disomy (UPD), akkor fordul elő, amikor mindkét allélt egy szülő továbbadja. 30-án
3-3. Táblázat A másolási szám állapotának és a B allél frekvenciájának kombinálásakor várható eredmények. Nexus másolatszám-kézikönyv (NEXUS MÁSOLATSZÁM, Biodiscovery, Hawthorne, USA) Megvalósítás: A nyers adatokat a Nexus 6 másolatszám-szoftver (Biodiscovery, El Segundo, Kalifornia) segítségével elemeztük, az NCBI pedig az emberi genom 36.1-es felépítésével készült. Ehhez az SNP-FASST2 szegmentálási algoritmust választották. 3.6 Polimeráz láncreakció (PCR) A PCR in vitro technikája lehetővé teszi az ismert DNS szegmensek által keretezett DNS szekvenciák célzott replikációját. A DNS replikálandó területét mesterségesen előállított primerek határolják, amelyek kiindulási segédanyagként szolgálnak. A primerek rövid, egyszálú DNS-molekulák, amelyek komplementerek a DNS-templát egy meghatározott szekvenciájának végeivel. A kétszálú DNS kezdeti denaturálódása után két egyszálúvá és az azt követő primer lágyítás után a DNS-polimeráz előre meghatározott reakciókörülmények között és 31
IDH-2 előre: 5 -AGAATTTTAGGACCCCCCGTCTG-3 IDH-2 hátra: 5 -AAAACCCCACTTCTGGTAAA-3 3.7 Agaróz gélelektroforézis A kapott PCR-terméket a DNS-fragmensek gélelektroforézissel történő elválasztásával detektáljuk. Elektromos tér alkalmazása a gélen a DNS-szegmenseket az anódhoz vándorolja, negatív töltésű foszfátmaradékaik miatt. Miután a DNS-sávokat etidium-bromiddal festettük, egy fluoreszcens festékkel, amely interkalálódik a DNS-sel, az egyes DNS-sávok egy standard használatával bizonyos mérethez rendelhetők. Anyag és oldatok: 2% agaróz gél (SERVA, Heidelberg, Németország) 100 μl etidium-bromiddal/100 ml gél oldat, 50 x TAE puffer (AppliChem, Darmstadt, Németország). Eljárás: A PCR-termékeket 2% -os agarózgélre helyeztük, és 100 V feszültség alkalmazása után 20 percig gélelektroforézissel elválasztottuk. 3.8 A szekvenáláshoz szükséges PCR tisztítása A szekvenálás során a jel átfedés elkerülése érdekében a PCR-terméket a szekvenálási reakció előtt meg kell tisztítani primerekből, felesleges nukleotidokból, sókból és Taq-polimerázból. 33
Anyag és oldatok: 3,85 μl víztávolság 0,1 μl 1U/μl SAP 0,05 μl 1U/μl 200U/μl Exo I 0,5 μl Exo I puffer 0,5 μl SAP puffer 5 μl PCR termék Eljárás: Az enzimatikus tisztításhoz a 10 μl teljes térfogatú reakcióelegyet a termikus ciklusban 30 percig 37 ° C-ra, majd 15 percig 85 ° C-ra melegítettük. 3.9 DNS-szekvenálás A szekvenálási módszer Sanger és munkatársai szerint. (106, 107), amelyet láncterminációs vagy dideoxinukleotid-módszerként is ismernek, elemezhető egyszálú cdna és gdna, amelyek denaturáció miatt egyetlen szálként vannak jelen a szekvenálási reakcióban. Fluoreszcenciával jelzett dideoxinukleotidok alkalmazásával (a négy ddntps mindegyike különböző fluoreszcencia markerhez van kapcsolva) a szekvenálási reakció egy reakcióelegyben történhet, mivel a négy ddntps mindegyikének sávjának detektálása más színjelet eredményez. Anyag és oldatok: 2 μl 10 mm-es alapozó TP362/TP363 2 μl enzimatikusan tisztított PCR-termék 8 μl víztartó 34
Ellenőrizze az amplifikációkat és a veszteségeket a DNS-szakaszokban. A FISH interfázisokat a TMA szakaszokon a Histology FISH tartozékkészlet (Dako, Hamburg, Németország) felhasználásával hajtottuk végre a gyártó utasításainak megfelelően. A 3-4. Táblázatban felsorolt FISH próbákat használtuk az amplifikációk és deléciók detektálására. A hibridizáció automatikus hibridizációs gépekben történt (Dako, Hamburg, Németország), és dr. Dido Lenze, Kórtani Intézet, Charité - Universitätsmedizin Berlin. 3-4. Táblázat: Az alkalmazott FISH-próbák összefoglalása A jel detektálására és mennyiségi meghatározására az Axio Imager Z1 (Zeiss, Jena, Németország) és az Isis szoftveren (5.3.1 verzió, MetaSystems, Altlussheim, Németország) került sor. Az egyes minták kópiaszámának kiértékeléséhez 20 nem átfedő tumorsejtmagban megszámoltuk a gén- és centromerspecifikus jeleket. Most összehasonlítottuk a génspecifikus szignálokat a centroméra-specifikus szignálokkal (génmásolatok száma: kromoszóma-kópiák száma). Az amplifikáció> 2,2 és 50% -os hányados volt. 50
4-6. Ábra Az IDH-1 és IDH-2 mutációanalízisének összefoglalása az IDH-1 és IDH-2 gének mutációinak reprezentatív példáival. 54.