A foszfolipidek és az oxidált lipidek szerepe az amiloid prekurzor feldolgozásában
A Saarlandi Egyetem Orvostudományi Karának kísérleti neurológia, elméleti orvostudomány és biológiai tudományok területéről Homburg/Saar A foszfolipidek és az oxidált lipidek jelentősége az amiloid prekurzor fehérje (APP) és az Alzheimer-kór feldolgozása során Doktori fokozat megszerzése A SAARLAND EGYETEM Orvostudományi Karának természettudományai, Viola J. Hauptenthal, született 1982. augusztus 24-én, Saarbrückenben
(3.2.9.) Az α-szekretáz és az ADAM-10 aktivitás meghatározása in vitro inkubálás után 25 (3.2.10.) Az Aβ, sappβ és sappα tartalom meghatározása. 26. (3.2.11.) Az ADAM-17, BACE-1 és PS-1 tartalom meghatározása. 27. (3.3.) Lipidanalízis. 28. (3.3.1.) Lipidek kivonása az ember post mortem agyából. 28. (3.3.2.) A DHA-stabilitás mérése. 28. (3.3.3.) A lipidtartalom meghatározása tömegspektrometriával. 28. (3.3.4.) A foszfolipidtartalom meghatározása vékonyréteg-kromatográfiával. 29. (3.3.5.) A HNE-tartalom meghatározása. 30 (3.3.6) A lipidperoxidáció meghatározása. 30 (3.4) RNS elemzés. 31. (3.4.1.) Az RNS izolálása. 31 (3.4.1) cdns szintézis és valós idejű polimeráz láncreakció (RT-PCR). 31. (3.5.) Statisztikai értékelés. 32. (4) kiadvány. 33 (4.1) Az 1. publikáció összefoglalása és az önrész leírása. 33 (4.2) A 2. publikáció összefoglalása és az önrész leírása. 69 (4.3) A 3. publikáció összefoglalása és az önrész leírása. 87 (5) Bővített összefoglaló. 102 (5.1) Lipidek AD-ben. 102 (5.2) Kontextusban: foszfolipidek, DHA és oxidált lipidek az APP feldolgozásában és szerepük az AD-ben. 104 (6) Összegzés és kilátások. 117 (7) Részvétel más kiadványokban. 119 (8) Irodalomjegyzék. 121 (C) Köszönetnyilvánítás. 133
Rövidítések (B) Rövidítések C Celsius fok µm mikromoláris AA arachidonsav Aβ amiloid β AD Alzheimer-kór ADAM α-szekretáz A-dezintegrin és metalloproteáz AICD intracelluláris APP-domén Aph engl. Elülső garat-defektív APO E apolipoprotein E APP amiloid prekurzor fehérje BACE β-szekretáz BSA Szarvasmarha szérum albumin COX ciklooxigenáz CTF C-terminális APP DHA dokozahexaénsav DMEM Dublecco s módosított sas táptalaj DNS dezoxiribonukleinsav ECE endotelin átalakító enzimek átalakító enzimek Etilénglikol-tetraecetsav EOAD Alzheimer-kór korai formája EPA Eikozapentaénsav FAD Alzheimer-kór familiáris formája FCS Magzati borjúszérum g/g gramm/gyorsulás a gravitáció következtében GSK3β Glikogén-szintáz-kináz 3 óra HBSS Sóoldat-pufferoldat primer neuronokhoz 3 H-HydroCR-H-HydroCR-H HD-HydroCR-H-HydroCR-H-HydroCR-H-HydroCR-H-HydroCR H 3-metil-glutaril-koenzim A-reduktáz 5
Rövidítések HNE 4-Hydroxynonenal HPLC nagy teljesítményű folyadékkromatográfia IDE Inzulinbontó enzim IP immunprecipitáció LDH laktát dehidrogenáz mérés LDL lipoprotein alacsony sűrűséggel LOAD Alzheimer-kór késői formája LOX lipoxigenáz LRP1 lipoprotein receptor 1 perc perc Me metanol 40 mm 40-millimólos NP-40 1 neuroprotektin-D1 NTF neurofibrilláris gubanc OD optikai sűrűség P p-érték, jelentőségi szint PBS foszfáttal pufferolt fiziológiás sóoldat PC-foszfatidilkolin PE-foszfatidil-etanol-amin PL-plazmalogén PS-foszfatidil-szerin PSEN engl. Presenilin enhancer RIP Szabályozott intramembrán proteolízis RNS ribonukleinsav RT szobahőmérsékletű RT-PCR valós idejű polimeráz láncreakció SAD Alzheimer-kór szórványos formája sapp oldható APP s második SDS nátrium-dodecil-szulfát PAGE poliakrilamid gél elektroforézis SPT szerin palmitoil-koenzim Wtiobarase 6
Bevezetés Az α-szekretáz levágása után a membránhoz kötött αctf-t hasítja a γ-szekretáz, amely felszabadítja a kis p3 fragmenst a citoszolos AICD-ben és extracellulárisan. Az amiloidogén útvonallal ellentétben a nem amiloidogén útvonalról származó AICD-t a sejten belül lebontja többek között az inzulinbontó enzim (IDE), ezért ennek az AICD-nek a transzkripciós relevanciája vitatott (Belyaev et al. 2010). A p3 funkciója még mindig nem világos. Az APP feldolgozásának áttekintését az 1. ábra mutatja. 1. ábra Az APP feldolgozás vázlatos ábrázolása, módosítva (Grimm, Rothhaar & Hartmann 2012). A jobb oldalon fent látható nem amiloidogén folyamatot az a- (zöld) és a y-szekretáz (kék) veszi át. Az oldható sappα és a membránalapú actf kezdetben képződik. Ezután p3 és AICD képződik. Az Aβ vöröset jelöl az APP-n belül. Az amiloidogén folyamat a bal alsó sarokban látható. A β-szekretáz elvágja az APP-t, ami sappβ-t és βctf-t eredményez. Ezután Aβ és AICD felszabadul a γ-szekretáz által. 16.
A sejtekben és az izolált membránokban található lipidek publikációját, amelyet S. Grösgen (S5. Ábra), a lipidek inkubációját hajtottam végre. A PC-, PE- és PS-tartalom vékonyréteg-kromatográfiával történő meghatározásához, amelyet B. Hundsdörfer végzett (S2 ábra), és a lipidprofil meghatározásához S. Grösgen (S5. Táblázat), a membránokat SH -SY5Y sejteket és humán post mortem agyakat izoláltunk. Az adatok statisztikai elemzését az ANOVA alkalmazásával, V. Zimmer és J. Lehmann együttműködésével végeztem (1-4. Ábra, S1-4. Táblázat). Az 1. kiadvány alább található. A kiadvány eredeti példánya megtalálható az MDPI AG (Bázel, Svájc) kiadó honlapján, a www.mdpi.com/journal/ijms címen, a doi szám alatt: 10.3390/ijms14035879. 35
Rothhaar és munkatársai: S1. Ábra: Citotoxicitás a lipid inkubáció után. S2. Ábra: A specifikusság ellenőrzése a szekretázvizsgálatban S3. Ábra A specifikusság ellenőrzése a szekretázvizsgálatban citotoxicitás 5 4 3 2 1 [%] n.s. n.s. fluoreszcencia (szekretáz aktivitás) [RFU] kontroll + szekretáz inhibitor fluoreszcencia (szekretáz aktivitás) [RFU] kontroll + szekretáz inhibitor PC 22: 6 PC-PL 22: 6 PE 22: 6 PE-PL 22: 6 0 2000 4000 6000 8000 idő [sec] 0 1000 2000 3000 4000 4000 5000 idő [sec] S4 ábra A specifikáció ellenőrzése a szekretáz vizsgálati fluoreszcenciában (szekretáz aktivitás) [RFU] kontroll + szekretáz inhibitor 0 2000 4000 6000 idő [sec] 86
Publikációk Az élő sejtekben végzett elemzés mellett elvégeztem az SH-SY5Y sejtekből származó membránok inkubálását és az ezt követő β-szekretáz aktivitás mérését, és statisztikailag értékeltem az adatokat (2c. Ábra). A szekretázok expressziójának meghatározását J. Mett végezte, miután a sejteket oxidált lipidekkel inkubáltam (2d. Ábra). T. Blümel meghatározta a β- és a γ-szekretáz aktivitását a DHA-val történő inkubálás után (eredmény a szövegben), C. Stahlmann-nál pedig a DHA-stabilitás (a szövegben eredményezett) után; Mindkét elemzéshez lipidekkel inkubáltam. A DHA-val és oxidált lipidekkel végzett inkubálás után az Aβ-szintek statisztikai értékelését N. Mylonas végezte (a szöveg eredménye). A 3. kiadvány az alábbiakban található. A kiadvány eredeti példánya megtalálható a S. Karger AG (Bázel, Svájc) kiadó honlapján, a www.karger.com/ndd címen, a doi szám alatt: 10.1159/000440839. 89