A hibák nagymértékű rekonstrukciója egy új hibrid vázból készült, poli
alanyok
absztrakt
bevezetés
A kritikus méretű csonthibák gyakori klinikai rendellenességek, amelyeket általában trauma, csontbetegség vagy daganatreszekció okoz 1. Az ebből eredő csontvesztés fiziológiailag nem helyrehozható, és általában nagy mennyiségű csontregenerációra van szükség 2. A csontgraftokat, például az autograftokat és az allograftokat széles körben alkalmazták csontindukcióhoz és nagy csontdefektusok gyarapításához 3 Ezeknek a csontgraftoknak azonban vannak bizonyos korlátai, amelyek a szintetikus csontgraft-helyettesítőket vonzó alternatívává teszik 4, 5 .
Eredmények
A PLLA/nHA/CM-AL keretrendszerek jellemzése
A keret morfológiája és porozitása
Az állványok morfológiai jellemzőit fénymikroszkóppal és SEM-mel szemléltettük, amint az a 3. ábrán látható. A keretek keresztmetszeti elemzése fénymikroszkóppal azt mutatta, hogy a fotikus zónák és a CH/nHA-AL (barna) egyenletesen oszlik el a keretekben (1A. Ábra). A SEM alatt a keretek homogén kapcsolatban álló porózus szerkezetet mutattak, 150–250 μm pórusátmérővel. Az állványok morfológiája nagyon különbözött a két állvány között (PLLA/nHA és CM-AL), a CH/nHA-AL részben beágyazódott a CM-AL állványokba (1A).
Különböző CH/nHA-AL koncentrációkat tartalmazó CM-AL keretrendszerek tulajdonságai. ( A. ) A CM-AL-k (0%), CM-AL-ok (10%) és CM-AL-ok (20%) morfológiája fénymikroszkópos (LM) és pásztázó elektronmikroszkópos (SEM) alatt; ( B. ) Különböző CH/nHA-AL tartalmú CM-AL keretek porozitása; ( C. ) Különböző CM-AL tartalmú CM-AL vázak nyomószilárdsága és modulusa; ( D. ) CM-AL állványok in vitro gyógyszer-felszabadulásának tesztelése akár 25 napig, CH/nHA-AL és PLLA/nHA/AL állványokkal kontrollként. Fekete nyíl jelzi a PLLA/nHA mátrixot, míg egy fehér nyíl a CH/nHA-AL mikrogömböket. * o
Különböző CH/nHA-AL tartalmú CM-AL keretek in vitro lebontása a 12 hetes megfigyelés során. ( A. ) A SEM alatt megfigyelt állványok morfológiai változásai; ( B. ) az elkészített állványok lebontó közegének pH-ja növekvő inkubációs idő mellett; ( C. ) A keret tömegének elvesztése a szétszerelési időszak alatt Fehér nyíl jelzi a CH/nHA-AL mikrogömböket. * o
A CM-AL állványok in vitro citokompatibilitása. ( A. ) A nyúl ASC sejtmorfológiája és adhéziója az állványokon SEM alatt; ( B. ) Az ASC-k citotoxicitási elemzése túlélte az állvány kimosódását MTT assay alkalmazásával; ( C. ) Az ASC-k alkalikus foszfát (ALP) aktivitása az állványos kimosó folyadékban; ( D. ) Az ásványosított mátrix szintézisét kalcium-lerakódás szempontjából elemeztük alizarinvörös festéssel. Fehér nyíl jelzi a CH/nHA-AL mikrogömböket. * p # p
A csontregeneráció röntgenanalízise az implantáció után különböző időpontokban. ( A. ) A csontregeneráció reprezentatív röntgenfelvételei különböző időpontokban. Néhány új csontképződés történt a kontrollcsoportban, de a csonthibát nem sikerült helyrehozni; Az autograft csoportban egy autológ ortotóp graft lehetővé tette a sugárhibák teljes gyógyulását a 8 hetes követés során; A CM-ALs (0%) implantátumok csoportjában nyilvánvalóan új csontképződés figyelhető meg a 8. héten. A csonttörési vonalakat alig figyelték meg, míg a csontvelő üregeinek térhálósodását nem találták. A CM-AL-k (10%) beültetett csoportjában a csonthibák 4-8 hét alatt új csontképződéssel gyógyultak meg. ( B. A szemikvantitatív elemzés szignifikáns új csontképződést mutatott a CM-AL-ban (10%) - a beültetett csoport összehasonlítva a CM-AL-okkal (0%) - a beültetett csoportban, és az adatok idővel növekedtek. * o
A csontregeneráció és az állványbontás szövettani elemzése az implantáció után különböző időpontokban. ( A. ) HE festés kis mennyiségű újonnan képződött trabekulát mutat 2 hét után mind CM-AL (0%), mind CM-AL (10%) csoportokban. A 4. és a 8. héten durva csonttrabekulákat mutattak be és csoportosítottak a jól látható érrendszerrel. A rostos szövetekkel töltött hiba továbbra is látható volt a CM-AL csoportban (0%), míg a CM-AL csoportban (10%) kevésbé volt látható. ( B. ) A kvantitatív elemzés megmutatta az új csontterület növekedését a beépített CM-AL-okkal és a napok növekedését. A fehér nyilak az új csontképződés területeit jelzik, míg a fekete nyilak a keretet (nagyítás: × 40). * o
A Masson festés mindkét csoportban az újonnan képződött csont fokozatos érését mutatta. Az újonnan kialakult csont erősen kékre festődött (amint azt a fehér nyíl mutatja) a 2. héten, és a kék terület fokozatosan zsugorodott, amikor a csont a 8. héten érett volt, jelezve, hogy az oszteogenezis mindkét csoportban már a 2. héten megkezdődött azonban az osteogenezis folyamata hosszabb ideig tartott a CM-AL (10%) csoportban, mint a CM-AL (0%) csoportban (nagyítás: × 40).
vita
Az in vitro degradációs vizsgálat a CM-AL állványok fokozott lebomlását mutatta a megnövekedett CH/nHA-AL tartalommal, és nem volt szignifikáns lebontási különbség a CM-AL állványok (10%) és a PLLA/nHA kontroll között. A pórusos CM-AL állványok in vitro lebontása során a pH-változás kisebb volt, mint a PLLA/nHA állványoké, ami a PLLA mátrix és a CM lebomlását is jelzi. Eközben a CM-AL állványok súlycsökkenési aránya jelentősen megnőtt, míg a mechanikai tulajdonságok lényegesen alacsonyabbak voltak. Ezek az eredmények összhangban voltak az előző vizsgálattal, amely azt mutatta, hogy a PLLA-alapú kompozitok súlycsökkenése a megnövekedett CM-adagolással nőtt, és ez a kitozán-komponens előnyös oldódásának tulajdonítható a kompozitokban 41. Felvetődött, hogy a bevezetett CM-ek gyors lebomlása hozzájárul az állványok súlyvesztéséhez a 37 korai szakaszban. Eredményeink összességében azt bizonyították, hogy a 10% CH/nHA-AL-t tartalmazó PLLA/nHA állványok előnyös tulajdonságokat mutattak, míg a CH/nHA-AL-tartalom 20% -ra való növelése okozta a káros hatást. Ezért a további vizsgálatokban 10% CH/nHA-AL-t tartalmazó PLLA/nHA állványokat használtunk.
Ennek a tanulmánynak azonban vannak bizonyos korlátai is. A molibdén-kék kolorimetriát elsősorban az AL-koncentráció meghatározására használták a vízben lévő foszfát-anion alapján. Bár a módszer bizonyítottan reprodukálható, pontos és alkalmas az AL 33, 48 meghatározására. PBS helyett azonban desztillált vizet használtak, amely a testfolyadék állandó pH-ját szimulálja, mivel a PBS-ből származó nagy mennyiségű foszfát zavarhatja az AL-meghatározást. Ezért jövőbeli munkánk során más módszereket is figyelembe lehet venni, amelyek jobban képesek szimulálni a testfolyadék állapotát.
Összefoglalva megállapítást nyert, hogy az AL kapszulába burkolt CH/nHA mikrogömbök sikeresen beépültek a PLLA/nHA alapú állványokba, és mikroszférán alapuló szállító rendszert fejlesztettek ki az AL bejuttatásához és a csontszövet tervezéséhez. A CM-AL állványok (10%) tartósabb hatóanyag-felszabadulást és hasonló mechanikai és lebomlási tulajdonságokat mutattak. Az ASC-k oszteogén differenciálódása szintén fokozódott, amit a jelentősen megnövekedett ALP-aktivitás és a kalcium-lerakódás bizonyít. Az in vivo vizsgálatok kiváló csontgyógyulást mutattak CM-AL-k (10%) állványaiból, összehasonlítva az autograftokéval. Ennek a tanulmánynak az eredményei tehát a CM-AL-k (10%) állványainak ígéretes alkalmazását javasolják a gyógyszerbeadáshoz és a csontszövet-tervezéshez.
Anyag és módszerek
PLLA gyártása
A PLLA-kat a laktid gyűrűnyitási polimerizációjával készítettük. Röviden, az L-laktid monomert (90%, Jiangxi Wuzangye Biochemical Industry Co., Ltd., Sanghaj, Kína) 140-150 ° C-on 4–5 órán át dehidratálták, majd 2,5–15 8,0 kPa és 170 ° C-on 6-8 órán át. A termékeket ón-oktát (0,27 kPa, 37 ° C) jelenlétében laktiddá polimerizáltuk. A laktidot ismételt átkristályosítással tisztítottuk etil-acetát oldószerként. A gyűrűnyitási polimerizációt PLLA előállítására hajtjuk végre laktid és ón-oktát, mint iniciátor és katalizátor jelenlétében (8000: 1). A PLLA kopolimert gélpermeációs kromatográfiával (GPC) és Fourier transzformációs infravörös spektroszkópiával jellemeztük, a korábban leírtak szerint 49.
Porózus CM-AL vázak gyártása
A PLLA/nHA/CM-AL állványok vázlatos ábrázolása csontregenerációhoz nagy szegmentális csonthibákkal rendelkező nyúlmodellben.
A PLLA/nHA/CM-AL keretrendszerek jellemzése
Morfológiai és porozitási tulajdonságok
A PLLA/nHA/CM-AL állványok morfológiáját fénymikroszkóppal (Olympus U-RFL-T, Tokió, Japán) és pásztázó elektronmikroszkóppal (SEM, Nova NanoSEM230, USA) tettük láthatóvá. Az állványok porozitását az Archimedes-elv szerint mértük, ahogyan azt korábban leírtuk 51. Röviden: a kereteket egy mérőhengerbe helyezték, amelyet bizonyos mennyiségű etanollal (V1) töltöttek meg. Az állványba merítés utáni teljes térfogatot (V2) és az etanol térfogatát, amely az állvány eltávolítása után a hengerben maradt (V3), rögzítettük. A porozitást ezután a következő egyenlet segítségével határoztuk meg:
Mechanikai tulajdonságok
A 20 ± 0,7 mm hosszú és 7 ± 0,5 mm szélességű kereteket előállítottuk, és vákuumban 24 órán át szárítottuk. A mechanikai tulajdonságokat Instron 1121 univerzális mechanikai vizsgálógéppel mértük szobahőmérsékleten 1,0 mm/perc terhelési sebességgel és 2 mm mechanikai deformációval. A nyomó modulust a DTM-II dinamikus rugalmassági modulus tesztelővel számoltuk (Xiangyi Instruments Co., Ltd., Xiangyi, Kína). Minden mintához három mintát teszteltünk.
In vitro gyógyszer szállítás
Az in vitro gyógyszer felszabadulást korábbi módszerünk szerint mértük, néhány módosítással 33. Röviden, mindegyik állványt 40 ml desztillált vízbe mártott dialízis tasakba helyeztük, és 25 napig 37 ° C-on, 45 fordulat/perc sebességgel rázattuk. A felülúszót (2 ml) minden nap összegyűjtöttük, és molibdén-kék kolorimetriás vizsgálattal meghatároztuk.
In vitro lebomlás
A téglalap alakú állványmintákat foszfátpufferoldatba (PBS) merítettük, és a pH-változás és a súlycsökkenés arányával követtük nyomon. A pH-t hetente egyszer mértük 16 héten keresztül. Az állványok súlycsökkenését a szétszerelés időszakában vákuumszárítás után 4 hetente jegyezték fel. Minden állványról három mintát készítettek minden egyes időpontra.
In vitro biokompatibilitási teszt
Sejtmorfológia és adhéziós vizsgálat
Az állványokat nyúlzsírból származó őssejtekkel (ASC-k, Cyagen Biosciences Inc., Guangzhou, Kína) tenyésztettük a sejtmorfológiai és adhéziós vizsgálat céljából. Az állványokat apró darabokra (7 mm x 7 mm x 1 mm) vágták és alacsony hőmérsékletű plazma sterilizálással sterilizálták. Az ASC-ket (1x104 sejt/ml, 100 μl) beültettük az állványokra, és 2 órán át inkubáltuk inkubátorban 37 ° C-on, hogy lehetővé tegyük a sejtek kapcsolódását. Ezután a Dulbecco-féle módosított sas-táptalajt (DMEM) 10% -os marha-magzati szérummal kiegészítve hozzáadtuk a hidratálás fenntartásához. A tenyésztés 2. és 5. napján a sejtekkel beoltott állványokat eltávolítottuk és háromszor gondosan PBS-sel mostuk. Az állványokon lévő sejteket ezután 4% formaldehiddel és ozmium-tetroxiddal immobilizáljuk 15-30 percig 4 ° C-on, és óvatosan háromszor mossuk PBS-sel. A mintákat ezután egymás után kétszer, 10 percig kétszer etanollal (50, 70, 90, 95 és 100%) dehidratáltuk. A mintákat kritikus ponton hagyták megszáradni, és arannyal bevonták a sejtmorfológia és adhézió SEM elemzésére.
In vitro citotoxicitási teszt
A 100 mg-os négyzet alakú állványlapokat (14 lemez, 7 mm × 7 mm × 1 mm/lemez) sterilizáltuk, és 20 ml tápközegbe 4 ° C-on 48 órán át merítettük. A nyúl ASC-ket (5x104 sejt/ml, 100 ul) 96 lyukú lemezekre oltottuk, és inkubátorban tenyésztettük 37 ° C-on 48 órán át, majd a táptalajt frissítettük. MTT-oldatot (1 mg/ml, 100 µl, Sigma-Aldrich) adtunk az egyes mélyedésekhez az 1., 3. és 5. napon, és 4 órán át inkubáltuk 37 ° C-on. A felülúszók eltávolítása után 150. 1 dimetil-szulfoxidot (DMSO, Sigma-Aldrich) adtunk hozzá a kék formazán-kristályok feloldásához. Az abszorbanciát 490 nm-en mértük ELISA olvasóval (Bio-Tek Instruments, Inc., Highland Park, VT, USA).
In vitro oszteogén differenciálás
A PLLA/nHA/CM-AL állványok oszteogén hatását in vitro elemeztük alkalikus foszfatáz (ALP) aktivitás vizsgálattal és alizarinvörös festéssel. A nyúl ASC-ket (5x104 sejt/ml, 120 µl/üreg) 12 lyukú lemezre oltottuk, amely állványokból kivont folyadékokat tartalmaz osteogén táptalajjal vagy anélkül (OGM, DMEM, 10% FBS (100 nmol/l dexametazon). 0,05 mmol/l aszkorbinsav és 10 mmol/l & bgr; -Glicerofoszfát). Az ALP aktivitást a 7. és a 14. napon mértük a 31. leírás szerint. Az alizarin vörös festéshez a táptalajt 3 naponta cseréltük. A sejteket a 7. és a 14. napon kaptuk, és 4% -os formaldehidben rögzítettük 15 percig. Miután kétszer mostuk PBS-sel, a mintákat 25 percen át alizarinnal (0,5 ml, 40 mmol/l, pH = 4,1) kezeltük. A képeket ezután fordított optikai mikroszkóp alatt készítettük (Nikon, Tokió, Japán). Legalább 3 véletlenszerűen kiválasztott mezőből számoltuk ki a pozitív sejtek százalékos arányát.
In vivo csontregeneráció
Statisztikai analízis
Az adatokat átlag ± szórásként (SD) fejeztük ki. A kísérleteket három példányban hajtottuk végre. A statisztikai összehasonlításokat Student t-teszttel vagy egyirányú varianciaanalízissel (ANOVA) végeztük. A 0,05 alatti P értékeket statisztikailag szignifikánsnak tekintettük.
hálaadás
Ezt a munkát a Kínai Nemzeti Természettudományi Alapítvány támogatta (támogatás száma: 81371934, szám: 81501860 és szám: 31470948), és részben a Kínai Ösztöndíj Tanács finanszírozta (támogatás száma: 201506370173).
Megjegyzések
Megjegyzés benyújtásával elfogadja a felhasználási feltételeket és a közösségi irányelveket. Ha valami visszaélést tapasztal, vagy nem felel meg feltételeinknek vagy irányelveinknek, kérjük, jelölje meg nem megfelelőnek.