A Hohenheimi Állattenyésztési és Tenyésztéstudományi Intézet állattenyésztési tanszékéről és
A Hohenheimi Egyetem Állattenyésztési és Tenyésztéstudományi Intézetéből Tárgyterület: Állattenyésztés és teljesítményfiziológia Prof. Dr. R. Claus A butirátképződés növekedése rezisztens keményítő etetésével sertésekben: Következmények a vastagbél nyálkahártyájának mitózisára és apoptózisának szabályozására Értekezés az agrártudományi doktori fokozat megszerzéséért, Joachim Mentschel, Landshut, 2004
A Hohenheimi Egyetem Állattenyésztési és Tenyésztési Intézetéből Tárgyterület: Állattenyésztés és teljesítményélettan Prof. Dr. R. Claus A butirátképződés növekedése rezisztens keményítő etetésével sertésekben: Következmények a vastagbél nyálkahártyájának mitózisára és apoptózisának szabályozására Értekezés az agrártudományi doktori fokozat megszerzéséért, Joachim Mentschel, Landshut, 2004
A jelen munkát 2004. március 12-én fogadta el a Hohenheimi Egyetem Agrártudományi Kar mint disszertáció az agrártudományok doktori fokozatának megszerzésére. A szóbeli vizsga napja: 2004. március 25. 1. dékánhelyettes: Prof. Dr. K. Stahr előadó, 1. vizsgabiztos: Prof. Dr. R. Claus társelőadó, 2. vizsgabiztos: Prof. Dr. H. Schenkel 3. vizsgabiztos: Prof. Dr. R. Mosenthin
Irodalmi áttekintés 2 Irodalmi áttekintés 2.1 A sertés emésztőrendszerének áttekintése A sertés emésztőrendszere fejre és törzsre oszlik. A fejbél az orr, a száj és a garat üregéből áll. A törzs felosztható az elülső részre (nyelőcső és gyomor), a középső vagy vékonybélre (duodenum, jejunum és ileum), a végbélre vagy a vastagbélre (vakbél, vastagbél és végbél) és a végbélnyílásra (Liebich, 1998). A törzsbél szerkezetét sematikusan mutatjuk be az 1. ábrán. 1. ábra: A törzsbél vázlatos ábrázolása sertésekben (Koch és Berg, 1990 után) 2I
Irodalmi áttekintés A sertések teljes belének hossza 20-27 m, ami a testhossz körülbelül 15-szerese. A duodenum kb. 0,95 m, az egész vékonybél a jejunummal és az ileummal kb. 15-20 m. A vastagbél hossza körülbelül 6 m, a vastagbélé pedig körülbelül 5 m (Loeffler, 1991; Bucher és Wartenberg, 1991). 2.1.1 A gyomor-bél traktus morfológiai alapjai és különlegességei A törzsbél minden szakaszának hasonló alapterve van (Liebich, 1998), de falszerkezetük tekintetében jelentős különbségek vannak (2. ábra). A vékonybél számos kriptából és villiból áll. A kripta rövidebb, mint a vastagbélé. Ezzel szemben a vastagbélben nincs villi. Jellemző a kripták (glandulae zarnasok) kialakulása, elágazatlanok és szorosan egymás mellett fekszenek. Saját emésztőenzimjei nem ürülnek ki a vastagbél nyálkahártyájából. Ezenkívül a vastagbél képes rosszul oldódó anyagok, például fémek kiválasztására. Ezenkívül, a vékonybéllel ellentétben, a vastagbélben nemcsak a perisztaltikus, hanem az antiperisztaltikus mozgások is fiziológiásak (Bucher & Wartenberg, 1991). 2. ábra: A vékonybél és a vastagbél különböző falszerkezetei (Potten, 1992 után) 3
Irodalmi áttekintés 2.1.2 A vastagbél morfológiai sajátosságai A vastagbél az embriogenezis során a középső és a végbél felől fejlődik ki. A felszálló vastagbél és a proximális keresztirányú vastagbél a középbélből fejlődik ki, a disztális keresztirányú vastagbél és a leszálló vastagbél a végbélből származik. Ezen eltérő fejlődés mellett emésztési élettani különbségek is vannak, így az erjedés fő helye a proximális területen helyezkedik el, de a felvett szubsztrátumtól függően distálisan is eltolható. Ezenkívül az emésztőrendszeri pép egyre jobban megvastagodik a disztális területen. Ezen okok miatt a vastagbelet proximális és disztális vastagbélnek nevezik ebben a cikkben. A proximális rész az emelkedő vastagbélből és a keresztirányú vastagbél proximális területéből, a disztális keresztirányú vastagbél és a leszálló vastagbél disztális területéből áll. 2.1.2.1 A vastagbél általános falszerkezete A vastagbél alapszerkezeti terve különféle réteges szövetekből áll (3. ábra); a lumenből kifelé tunika nyálkahártya, tela submucosa, tunica muscularis, tela subserosa és tunica serosa néven említik őket. 3. ábra: A vastagbél keresztmetszete (Liebich, 1998) 4I
Irodalmi áttekintés 2.2 A gyomor-bél traktus feladatai A gyomor-bél traktus elsődleges feladata, hogy a bevitt ételt összetevőire bontsa olyan mértékben, hogy az felszívódhasson a test belsejébe. Az emésztési folyamat a szájüregben lévő élelmiszer-összetevők mechanikus lebontásával kezdődik. Az étel lenyelése után a szénhidrátok, a fehérjék és a zsírok megemésztődnek. A bél emésztése enzimeken keresztül zajlik. A fő tápanyagok lebontása során a test saját enzimjeinek áttekintését az 5. ábra adja. 5. ábra: A szervezet saját enzimjeinek áttekintése a fő tápanyagok lebontása során (Simon, 1995 szerint) A vékonybél enzimek hatékonysága a vastagbélben folyamatosan csökken. Ehelyett a szénhidrátokat és fehérjéket lebontó bélbaktériumok és protozoonok veszik át a vastagbélben megmaradt élelmiszer-összetevők emésztését. Az ásványi anyagok és a víz felszívódása mellett a vastagbél feladata a B- és K-vitamin szintézise és főleg a 7
Irodalmi áttekintés 3. táblázat: Az acetát, a propionát és a butirát mólaránya az emberi ürülék 24 órás inkubálása után különböző szénhidrátokkal (Cummings & Macfarlane, 1997 szerint) SCFA szubsztráthozama (%) Mólarányok (%) acetát-propionát-butirát-keményítő 49 62 15 23 korpa (búza, 40 64 16 20 zab) fruktooligoszacharid - 78 14 8 pektin 39 80 12 8 egyéb NSP 38 63 22 8 beleértve: guargumi arabinogalaktán 62 43 59 57 27 31 11 11 élelmiszer-összetevők, mint például cellulóz, hemicellulózok, pentozánok (Berggren et al., 1993; Bourquin és mtsai., 1993; Knudsen és mtsai., 1993) enyhe butirát fermentációhoz vezetnek, miközben megnövekedett butirát koncentráció érhető el, különösen rezisztens keményítők esetén. 4. táblázat: Az acetát, a propionát és a butirát moláris aránya 24 órás sertésszéklet különböző keményítőkkel történő inkubálása után (Martin és mtsai., 1998). A szubsztrát moláris aránya (%) acetát-propionát-butirát nyers búzakeményítő 56 25 17 nyers kukoricakeményítő 62 21 16 nyers borsókeményítő 62 21 15 nyers amiloma kukoricakeményítő 47 28 23 retrográd 54 54 14 amiloma kukoricakeményítő nyers burgonyakeményítő 55 19 25 11
A szöveti homeosztázis fenntartásával kapcsolatos szakirodalom áttekintése. Szorosan összefügg a mitózissal, mivel ha a szövetek sejtjeinek száma változatlan marad, ugyanannyi sejt képződik, ahány mennyiséget elveszít a sejthalál (Kerr et al., 1972). Ennek megfelelően a sejtvesztés szabályozásának jól definiált mechanizmusoknak kell fennállniuk az állandó sejttermelésű szövetekben (Ansari & Hall, 1992). Feladataik a felesleges, sérült vagy fertőzött sejtek eltávolítása (Thompson, 1995). Az apoptózis hibái különféle klinikai képekhez vezethetnek. Ha a mitotikus arány ugyanaz marad, a növekedés szöveti atrófiához vezet. Egyrészt a pro-apoptotikus kontrollmechanizmusok aktiválása szövetdegenerációhoz vezethet (Que & Gores, 1997), másrészt az apoptózis hibái megkönnyítik a normál szövet neoplasztikus szövetekké történő átalakulását. Ezen okokból az apoptózis befolyásolására vonatkozó farmakológiai stratégiákat tárgyalják. Így a hámsejtek apoptózisának gátlása javíthatja a szövetek megújulási és helyreállítási folyamatait a gyomor-bél traktusban, míg a rosszindulatú szövetekben az apoptózis kiváltása nagy terápiás haszonnal járhat (Que & Gores, 1997). 2.4.1 Sejtosztódás: mitózis A sejtosztódás folyamatát, amelynek révén új sejt jön létre ugyanolyan számú kromoszómával, mint az eredeti sejtben, mitózisnak nevezzük. A mitózisban mindegyik kromoszóma két egyenlő részre oszlik, amelyek a sejt ellentétes végei felé haladnak. Sejtosztódás után a két leánysejt mindegyikének azonos kromoszómája és génje van, mint az eredeti sejtnek. Az egyszerűen felépített protozoonák és néhány többsejtű faj a mitózis révén szaporodik; Ezen túlmenően az élőlények ezen a folyamaton keresztül nőnek (hiperplázia), és az elhasznált sejteket kicserélik. Ez ellentétben áll a sejtnövekedéssel (hipertrófia), amelyet csak a sejttömeg vagy a sejtméret növekedéseként kell érteni. A gyomor-bél traktus nyálkahártyájában az enterociták mindig olyan őssejtekből kerülnek ki, amelyek a kripta alsó területein helyezkednek el (Bach et al., 2000). A szaporodó sejtek azonosításához specifikus változásokat kell kimutatni, például a proliferációval járó géntermékeket. Ezen proliferációval kapcsolatos gének képviselői a következők: megbeszélte az onkogéneket. A krónikus sejtciklus (7. ábra) nagy jelentőséggel bír a mitózis azonosításában. Ez négy fázisra oszlik (G1, S, G2 és M). Az S Pha- 14 I alatt
Az irodalom áttekintése a DNS szintézisén megy végbe, az M fázis mitózisában, a kromoszómák felosztásával. A G1 és G2 fázisokban (résfázisok) előkészítik a következő S és M fázisokban zajló folyamatokat. Azok a sejtek, amelyek nem mennek keresztül a sejtcikluson, a G0 fázisban vannak. A mitózis kezdete MR G2 G0 G1 S A DNS-szintézis kezdete 7. ábra: A sejtciklus sematikus ábrázolása A mitózis detektálása meghatározható bizonyos markerekkel, például PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) és a nukleáris antigén (Ki67) (Potten) detektálásával. És Loeffler, 1990). A PCNA fehérje osztódó sejtekben szintetizálódik. Az e fehérje ellen irányított antitestek osztódó sejtekkel, beleértve a tumorsejteket, reagálnak, a nyugalmi szakaszban lévő sejtekkel azonban nem (Mathews és mtsai 1984). A Ki67 antitest egy nukleáris antigént detektál, amely jelen van a szaporodó sejtekben, de a nyugalmi sejtekben nem. A ciklikus fázisú sejtek, beleértve a G1-et, Ki67 pozitívak, míg a G0 fázisban lévő sejtek nem expresszálják az antigént (Baisch & Gerdes 1990). 15-én
Irodalmi áttekintés 10. ábra: Az apoptózis sematikus ábrázolása (Kerr, 1993 szerint) 2.4.4.2 Az apoptózis lefolyása Az apoptózis különböző kontrollmechanizmusok segítségével indítható (11. ábra). Ebben az összefüggésben különbséget kell tenni a receptor által közvetített apoptózis és a mitokondriális út között. 21.
Irodalmi áttekintés A receptor által közvetített apoptózis útvonal olyan receptorokon keresztül indul meg, mint a CD95. A CD95 ligandum CD95-hez való kötődése indukálja a szignál komplexet, amely a prokaszpáz 8 molekulákat toborozza FADD (Fas-asszociált haláldomén fehérje) segítségével, és ezért felelős a kaszpáz 8 aktiválásáért (Hengartner, 2000). A mitokondrium központi szerepet játszik az apoptózis szabályozásában. A mitokondriális útvonalat kiválthatják extracelluláris tényezők vagy DNS károsodás. A Bcl-2 család fehérjéi részt vesznek ebben a szabályozási mechanizmusban. Ennek a családnak a pro- és anti-apoptotikus képviselői kapcsolatba lépnek a mitokondriumokban, és szabályozzák a különféle molekulák, például a citokróm c, felszabadulását, amelyek az apaf-1-vel és a prokaszpázzal 9 együtt aktiválhatják az effektor kaszpázokat. A diagramban bemutatott további részletes mechanizmusokat ebben a munkában nem tárgyaljuk tovább, részletesebb magyarázatokat Hengartner (2000) publikációjában találhatunk. 11. ábra: A legfontosabb apoptózis útvonalak vázlata (bal: receptor által közvetített apoptózis út; jobb: mitokondriális apoptózis útvonal, Hengartner, 2000 szerint) 22 I.
Irodalmi áttekintés A bcl-2 család tagjai Mitokondrium Cytochrome c felszabadulás A kaszpasz kaszkád aktiválása Apoptózis 12. ábra: Az apoptózis kaszkád modellje Bcl-2, mitokondrium, citokróm c és kaszpázok útján 2.4.5.1 Apoptózis-szabályozó fehérjék: Bcl-2 család Bcl-2-t használtunk protonként azonosított. A gént először B-sejtes lymphomában fedezték fel. Egérsejtvonalakon végzett kísérletek a bcl-2 apoptózisra gyakorolt hatását is kimutatták (Vaux et al., 1988). Míg a Bcl-2 számos magzati szövetben megtalálható, a felnőtt szövetekben ez a fehérje főleg a gyorsan osztódó és differenciálódó sejtekben expresszálódik. További vizsgálatok során számos olyan gént találtak, amelyek szekvencia-homológiával rendelkeznek a bcl-2-vel (Yang & Korsmeyer, 1996; Reed, 1997). Az aminosav-szekvencia, a biológiai hatás és a funkció jellemzése különféle megfigyelésekhez vezetett. Ennek megfelelően a Bcl-2 fehérjék családjába mindkét Ver 25 tartozik
Irodalmi áttekintés Bcl-2, Bcl-X-L, Bid vagy saját maga (Sattler et al., 1997). A Bax ellensúlyozza az anti-apoptotikus Bcl-2 fehérjét; minél magasabb a Bax koncentrációja a Bcl-2-hez képest, annál nagyobb a hatása. A Bax/Bax homodimerek, a Bcl-2/Bax heterodimerek és a Bcl-2/Bcl-2 homodimerek relatív aránya döntő fontosságú az apoptózis kivitelezésében. Ha a Bax-homodimerek dominálnak, akkor a sejthalál bekövetkezik, a Bax/Bcl-2 heterodimerek túlsúlya a sejtek túléléséhez vezet (Sato et al., 1994). Néhány tanulmány azonban azt is kimutatta, hogy a dimerizáció mértékétől függetlenül a Bcl-2 és a Bcl-x gátolhatja az apoptózist, vagy hogy Bax elősegítheti az apoptózist is (St Clair et al., 1997; Zha & Reed, 1997) (13. ábra). Ezenkívül úgy tűnik, hogy a Bak proapoptotikus hatása független a Bcl-X-L és Bcl-2 heterodimerizációjától (Simonian et al., 1997). a: bax bcl-2 bcl-2 bax b: 13. ábra: A bcl-2 család tagjainak fehérje-fehérje kölcsönhatását bemutató diagramok (a: módosítva: Mathers, 1998; b: Sato és mtsai, 1994) 27