A kurkumin és a decetén-kurkumin antikarcinogén aktivitásának in vitro és in vivo elemzése am
A humán genetika, az elméleti orvostudomány és a biológiai tudományok vagy a Saarlandi Egyetem Orvostudományi Karának klinikai orvostudománya, Homburg/Saar. A kurkumin és a decétum kurkumin anti-karcinogén aktivitásának in vitro és in vivo elemzése az egér rosszindulatú melanomáján. Természettudományi Kar Orvostudományi Egyetem, 2014. SZAK SAJÁT EGYETEM: benyújtotta: Indra Navina Dahmke, született: 1979. december 1-jén, Koblenzben
Előléptetési nap: Dékán: Prof. Dr. M.D. Menger 1. riporter: Prof. Dr. E. Meese 2. előadó: PD Dr. M.W. Laschke
Apám emlékére, aki megismertetett a természettel
Tartalom I Tartalom 1. Összefoglalás. 1 2. Bevezetés. 5 2.1. Malignus melanoma. 5 2.2. Kurkumin. 6 2.2.1. A kurkumin kémiai tulajdonságai. 9 2.2.2. Kurkumin farmakokinetika. 10 2.2.3. A kurkumin farmakokinetikája emberben. 11 2.2.4. A biohasznosulás javítása. 11 2.2.5. Toxicitás. 12 2.2.6. A kurkumin farmakodinamikája emberben. 12 2.2.7. A kurkumin molekuláris célpontjai. 13 2.3. MiRNA-k. 15 2.4. Saját kérdés. 18 3. Anyag és módszerek. 19 3.1. Laboratóriumi anyagok. 19 3.2. Sejtbiológiai módszerek. 19 3.2.1. Használt sejtvonalak. 19 3.2.2. A sejtek tenyésztése. 19 3.2.3. Az elsődleges humán perifériás mononukleáris sejtek izolálása. 20 3.2.4. Sejtek száma. 21 3.2.5. WST-1 assay. 22 3.2.6. Áramlási citometriás elemzések. 22 3.2.6.1. A citotoxicitás meghatározása. 24 3.2.6.2. A sejtciklus fázisainak meghatározása. 25 3.2.7. Fluoreszcens mikroszkópos elemzés. 25 3.3. Molekuláris biológiai módszerek. 26 3.3.1. RNS izolálása tumormintákból. 26 3.3.2. A mirna profil nagy áteresztőképességű elemzése. 27 3.3.3. A sejtes jelátviteli utak in silico elemzése. 29 3.3.4. Kvantitatív valós idejű PCR mirnákból. 29 3.3.4.1. Fordított átírás. 29 3.3.4.2. Kvantitatív valós idejű PCR (qrt-pcr). 30-án
Tartalomjegyzék III 4.2.2. Proliferáció és apoptózis a háti bőrkamra modelljében. 58 4.2.3. Daganatnövekedés és neoangiogenesis a szélső tumor modellben. 58 4.2.4. Az NF-κB expressziója szélső daganatokban. 60 4.2.5. A szélső daganatok MiRNS-profilja. 60 4.2.6. A releváns mirnák kifejeződése melanoma sejtvonalakban. 64 4.2.7. Feltételesen szabályozott jelátviteli utak. 65 4.2.8. Mirna-205-5p célok. 66 5. Megbeszélés. 68 5.1. A pirolitikus folyamatok hatása a kurkuminra. 68 5.2. Az étrendi kurkumin hatása a melanomára. 71 5.3. Következtetés és kilátások. 79 6. Irodalomjegyzék. 81 7. Köszönetnyilvánítás. 94 8. önéletrajz. 95 9. Publikációk. 96 10. Függelék. 97
Rövidítések listája IV Rövidítések listája ábra Akt-protein-kináz Akt, protein-kináz-B al. alii APC Allophycocyanin APS ammónium perszulfát Bcl-2 B-sejtes limfóma 2 BDMC Bidemethoxycurcumin bp basepare BRAF v-raf egér szarkóma virális onkogén homológ B1, szerin/treonineprotein kináz B-Raf C szén Ca kalcium CD kluster differenciálódás CdK kit tirozin kináz KIT Cl-klorid c-myc myc myelocytomatosis vírusos onkogén homológ COX-2 ciklooxigenáz 2 CTLA-4 citotoxikus T-limfocita antigén 4 Cur, CUR kurkumin redisztál. kétszer desztillált DEPC dietil-pirokarbonáttal DHC dihydrocurcumin DKC decetene kurkumin DMC demetoxi DMSO demetil-szulfoxid DNS deoxyribonuleic sav dNTP dezoxi-ribonukleozid-trifoszfát DTT ditiotreitol dUTP 2-dezoxiuridin hatékony epizód 2-dezoxiuridin átmenetet 1-fél-epiphosphate, korai epiphytic fehérje átmenet, 5-a-1-biszfoszfát fehérje koncentráció 50, transymptive-fél-epiphosphate, 5-a-1-desoxyuridine, 5-a-1-biszfoszfát maximális reakció. HER, EGFR humán epidermális növekedési faktor receptor/eritroblasztos leukémia vírusos onkogén homológ ESR1 ösztrogénreceptor alfa FACS fluoreszcencia-aktivált sejtválogatás FDA Élelmiszer- és Gyógyszeradminisztráció g Gramm G1 Gap1 G2 Gap2
Rövidítések listája V GFP zöld fluoreszcens fehérje H hidrogén óra Hepes 2- [4- (2-hidroxietil) piperazin-1-il] etánszulfonsav HIF-1α Hypoxia-indukálható faktor-1alfa hsa Homo sapiens ICAM-1 sejtközi adhéziós protein-1, CD54 IgG immunglobulin G ip intraperitoneális IRAK1 interleukin-1 receptorhoz társult kináz 1 iv. intravénás IVM intravitalis fluoreszcens mikroszkópia kapa B kda kilodalton IKB inhibitora KEGG Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes kg testtömeg-kilogramm M 1 G malondialdehid-DNS ma milliamper Me metilcsoport µg mikrogramm µl mikroliter µm mikrométer perc mg milligramm mg magnézium micorna. mirisc mirna által kiváltott hangtompító komplex átlagos átlag milliliter mm milliméter mmu Mus musculus mol Mol mrna messengerrna mtor emlős rapamicin célpont (szerin/treonin protein kináz) n szám Na nátrium NF-κB magfaktor-kappa béta ng nanogramm nm nanométer O oxigénatom túlreprezentáció-elemzés
A rövidítések listája VI p53 tumorfehérje 53 PAGE poliakrilamid gél elektroforézis PBS posfátpufferolt fiziológiás sóoldat PCAF P300/CBP-asszociált faktor PCNA proliferáló sejtmag antigén PCR polimeráz láncreakció PECAM, CD31 thrombocyta endoteliális sejtadhéziós molekula PI propidium jodid p. o. per os PPAR-γ peroxiszóma proliferátor által aktivált receptor-γ PTEN foszfatáz és tenzin homológ PYR pirolizált kurkumin qrt-pcr kvantitatív valós idejű polimeráz láncreakció RNS ribonukleinsav S szintézis lásd alább SDS nátrium-dodecil-szulfát SEM az átlagos SP1 specifitás standard hibája protein 1 transzkripciós faktor Src Tirozin-kináz Src (szarkóma) T nap tonna TBS-T Tris-pufferolt sóoldat és Tween 20 TE Tris-EDTA puffer TNF-α tumor nekrózis faktor-alfa TPA 12-O-Tetradekanoil-forbol-13-acetát Tris 2- Amino-2-hidroxi-metil-propán-1,3-diol t-teszt Student s t-teszt USA ultrahang VAV proto-onkogén vav VCAM-1 érsejt-adhéziós molekula-1, CD 106 w/v súly/térfogat WHO Egészségügyi Világszervezet WST- 1 vízoldható tetrazolium-1 xg gravitáció miatt n-szer gyorsul, pl. például C Celsius fok
A 2. összefoglalás és a humán melanoma sejtvonalak kvantitatív valós idejű polimeráz láncreakcióval (qrt-pcr) történtek. Az étrendi kurkuminnal szabályozott mirnák feltételezett célpontjainak elemzése azt mutatta, hogy felülreprezentáltak voltak a sejtes jelátviteli utak O-glikán bioszintézisében, a fehérje feldolgozásában az endoplazmatikus retikulumban és a rákhoz kapcsolódó különféle jelátviteli utakban. Western-blot-analízis azt mutatta, hogy az anti-apoptotikus B-sejtes CLL/lymphoma 2 (Bcl-2) és a proliferáló sejtmag antigén (PCNA) szignifikánsan alacsonyabb szintű volt a kurkuminnal kezelt tumorokban. Összefoglalva, e munka eredményei azt mutatták, hogy a decetén-kurkumin, amely a rákos sejtekre mérgezőbb, mint a kurkumin, a szokásos háztartási főzés során pirolitikus lebontással képződik. Ezenkívül a mirna-aláírás alapvető változását mutatták be az átültetett melanomákban az étrendi kurkumin miatt. Itt az mmu-mir-205-5p-t szabályozták a legjobban. Az orálisan beadott kurkumin hatása a daganatok fontos szabályozó hálózatára bebizonyosodott, és hangsúlyozza a kurkumin potenciális előnyeit a rosszindulatú melanoma kezelésében.
A 4. összefoglalás gazdagodott o-glikán bioszintézissel, endoplazmatikus retikulum fehérje feldolgozással és különböző rákkal kapcsolatos utakkal. A Western blot elemzések azt mutatták, hogy ezek közül a célpontok közül az anti-apoptotikus B-sejtes CLL/lymphoma 2 (Bcl-2) és a proliferáló sejtek nukleáris antigénje (PCNA) szignifikánsan alacsonyan volt szabályozva a kurkuminnal kezelt tumorokban. Összefoglalva, ennek a tézisnek a megállapításai azt mutatják, hogy a deketén-kurkumin, amely a közös háztartási főzés során kialakuló pirolitikus lebomlás következtében keletkezik, erősebb toxicitást mutat a rákos sejtekre a kurkuminnal összehasonlítva. Ezenkívül az étkezési kurkumin a mirna-aláírás mélységes változását okozta a beültetett melanomában, az mmu-mir-205-5p volt a legjelentősebb. Dokumentálták az orálisan beadott kurkumin hatását a daganatok fontos szabályozó hálózatára, és aláhúzza a kurkumin potenciálját a rosszindulatú melanoma kezelésében.
Bevezetés 7 2. ábra: Curcuma longa. V: A kurkuma növény rajza (Köhler, 1887). B: A rizómák és a kurkuma por fényképe. A kereskedelemben kapható kurkumin általában körülbelül 80% kurkumint tartalmaz, és hasonló aktivitási spektrumú növényi bioszintézis intermediereket is tartalmaz, például demetoxi-kurkumint (
17%) és a bidemetoxi-kurkumin (
3%) (3. ábra). Míg a kurkumint elsősorban színező élelmiszer-adalékanyagként (E100, Természetes sárga 3) használják Európában és az Egyesült Államokban, fogyasztása és felhasználása a hagyományos orvoslásban Délkelet-Ázsiában elterjedt. A kurkumint több mint 2000 éve használják a hagyományos ázsiai konyhában a curry fő összetevőjeként és az édességek színezésére, valamint fertőzések és belső betegségek gyógykezelésére használják (Ammon, 1991; Eigner és Scholz, 1999). India 80% -os részesedéssel (kb. 800 000 t 2010-ben) a világ legfontosabb kurkuma-termelője, amelynek 90% -át tovább feldolgozzák a hazai piacon (Universal Commodity Exchange, 2012). Az átlagos fogyasztás 2,0-2,5 g kurkuma naponta és személyenként, és legfeljebb 100 mg kurkumin bevitelének felel meg (Chainani-Wu, 2003). Összehasonlításképpen, az Egyesült Királyságban az Európai Élelmiszerbiztonsági Hatóság becslései szerint napi 0,8-3,3 mg/testtömeg-kg fogyasztanak felnőttek (Európai Élelmiszerbiztonsági Hatóság, 2010).
Bevezetés 10 különböző arányú transz-6- (4-hidroxi-3-metoxi-fenil) -2,4-dioxo-5-hexanal, ferulasav, feruloil-metán és vanillin (Wang et al., 1997). A kurkumin könnyen oldódik szerves oldószerekben, például alkoholokban vagy demetil-szulfoxidban (DMSO), de csak nehezen képes vízben. Ez a sejtek felszívódásának csökkenéséhez vezet a belekben, és következésképpen csökken a biohasznosulás. 2.2.2. A kurkumin farmakokinetikája A kurkumin farmakokinetikájával kapcsolatos preklinikai és klinikai vizsgálatok alacsony szisztémás biohasznosulást és gyors első passz metabolizmust és az elsődleges anyag kiválasztását mutatták. Wahlström és Blennow (1978) egyik első tanulmánya azt mutatta, hogy a Sprague-Dawley patkányokban orálisan beadott kurkumint a májból az epébe aktívan szállítják, és 75% -a ürül a széklettel. Csak kis része volt kimutatható a plazmában és a vizeletben. 6. ábra: A kurkumin metabolizmusa (módosítva: Sharma, 2005) A kurkumin biliáris kiválasztódását viszont a multirezisztencia-asszociált protein 2 (MRP2) közvetíti (Lee és mtsai, 2012). In vitro kísérletekben is
A 21. anyagot és módszereket hideg PBS-sel mossuk, majd a sejteket manuálisan megszámoljuk egy Neubauer-számláló kamrában (hemocitométer). Vörösvértest-lízis puffer: 788 mg (10 mm) Tris-HCl 4,41 g (165 mm) NH 4 Cl vegyi anyagok 500 ml-es aqua bidistában. feloldjuk és 4 C-on tároljuk. 3.2.4. Sejtszámlálás A sejtszámláláshoz 10 µl sejtszuszpenziót összekevertünk 10 µl tripánkékkel (hígítási tényező: 2), és a létfontosságú (nem festett) sejteket egy Neubauer-számláló kamrában számoltuk meg (10. ábra). A tripán kék színezék behatol a sérült sejtmembránokba, és ezáltal megjelöli a nem létfontosságú sejteket. A sejtszuszpenzió második 10 µl-es alikvot részét összekeverjük Turk oldatával, és a fehérvérsejtek számának meghatározása céljából a Neubauer számláló kamrába adjuk. A Türks oldatban található ecetsav lizálja az eritrocitákat, így azok kékre festődnek. 10. ábra: Neubauer számláló kamra. V: Hemocitométer sematikus ábrázolása keresztmetszetben. B: A számlálási terület sematikus ábrázolása. A számlálandó kvadránsokat piros színnel vázoljuk (Woermann, 2000). A létfontosságú PBMC-k kiszámításához figyelembe kell venni a számláló kamrában lévő folyadék térfogatát és a sejtek hígítását a festőoldatokban. A terület
ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 29 A mirna expressziós szintjének megállapításához a kontroll és a kezelési csoport között a független, kétoldalas Student t-tesztet alkalmaztuk. A kiszámított P-értékeket korrigáltuk a hamis felfedezési rátával (FDR) az ismételt teszteléshez (Benjamini és Hochberg, 1995). A deregulált mirnák korrigált P értéke 20%, a tumor átmérője> 15 mm és a szöveti nekrózis kialakulása. Hacsak másként nem írjuk le, a beavatkozások intraperitoneális ketamin-xilazin altatásban történtek (ketamin: 75 mg/kg, Ketanest, Pharmacia GmbH, Erlangen, Németország; xilazin: 15 mg/kg, Rompun, Bayer, Leverkusen, Németország). A kísérletek befejezése után az állatok túladagolták a pentobarbitált (200 ug)
Anyagok és módszerek 46 18. ábra: Intravitalis fluoreszcencia mikroszkópia. A fluoreszcens mikroszkóp (FM) beállítása higanygőz-lámpával (HBO), távolsági lencsékkel (LDO) és videokamerával (VK) és DVD-felvevővel (DVD) rendelkező videodokumentációs rendszerrel. Az adatokat offline módon értékeltük a CapImage szoftver segítségével (Zeintl, Heidelberg, Németország). Az elemzések magukban foglalták a tumor méretének [mm 2] és a funkcionális kapilláris sűrűség [cm/cm 2] mérését. Ezt úgy definiáljuk, mint a látómezőnkénti perfundált erek teljes hosszát. Ebben a munkában a teljes tumor szferoid funkcionális kapilláris sűrűségét elemeztük. 3.10. Széldaganatos modell A szárdaganatok generálása és az ultrahangmérések Jeannette Rudzitis-Auth, a Saarlandi Egyetem Klinikai-Kísérleti Sebészeti Intézetének szíves támogatásával történtek. 3.10.1. A szélső daganatok kialakulása A szélső daganatok előállításához a hím C57BL/6 egereket rövid ideig altattuk 4% izoflurán és oxigén keverékével. Minden egeret szubkután 1 x 105 B78H1 melanóma sejtet injektáltunk szárnyonként, 50 μl PBS térfogatban.
Anyag és módszerek 50 vonatkozik. Az utólagos elemzések során az alfa hibát Bonferroni szerint korrigáltuk az ismételt mérések korrigálása érdekében. P értéke