A leptin befolyásolja a bél hámsejtjeinek forgalmát a leptin receptor expressziójával összefüggésben

• absztrakt
• Fő
• ANYAGOK ÉS METÓDUSOK
• Állatok.
• Kísérleti terv.
• Sebészeti eljárás.
• A bél beállításának paraméterei.
• Szövettani vizsgálat.
• Lézeres befogási mikrodisszekció és RNS előkészítés.
• RT-PCR.
• Valós idejű PCR.
• A kriptasejtek szaporodása és az enterocita apoptózis.
• Bax és Bcl-2 gének expressziója.
• Statisztikai analízis.
• EREDMÉNYEK
• A bél beállításának paraméterei.
• Enterocita proliferáció és apoptózis a jejunumban.
• A LEPr expresszió hosszú formája és az enterocita forgalom ilealis kriptákban.
• A LEPr expresszió és az enterocita apoptózis hosszú formája az ilealis villusokban.
• Apoptózissal kapcsolatos gének expressziója.
• VITA
• szójegyzék

absztrakt

A rövid bél szindróma (SBS) különböző kísérleti modelljeivel végzett kiterjedt vizsgálatok kimutatták, hogy az enterocita apoptózis döntő szerepet játszik a bél reszekció utáni adaptációjában (1, 2). A bél hiperplázia szükségessége ellenére a mitotikus ingerek nem képesek elnyomni a programozott sejthalált (3). Sok kutató a megnövekedett enterocita apoptózist olyan mechanizmusként írta le, amely kompenzálja a megnövekedett enterocita proliferációt, hogy új homeosztatikus sebességet érjen el a bél kiigazításakor (4). A fokozott apoptózis elősegíti a genetikailag aberrált őssejtek megsemmisülését és megakadályozza a tumor fejlődését (3, 4).

A bél adaptációja a bél reszekciója után a bél hámsejtjeinek fokozott szaporodásához, valamint megnövekedett programozott sejthalálhoz vezet, amely felgyorsult sejtforgalmat jelez. Ezeknek a műveleteknek az eredménye segít a kripta villi struktúrák alakításában hosszabbított és funkcionálisan aktívabb egységekké. A sejtermelés és a sejtvesztés egyensúlyának szabályozása a bél reszekciója után a bél reszekciója során bonyolult, és az adaptációs folyamatot irányító pontos tényezők továbbra sem tisztázottak (11, 12). Különösen nem világos, hogy ezek közül a trofikus tényezők közül sokan hová hatnak a kripta-villus tengely mentén. A legfrissebb eredmények azt sugallják, hogy a különböző növekedési faktorok, mint például a keratinocita növekedési faktor (13) és az epidermális növekedési faktor (14), különböző módon fejeződnek ki a kripta-villus tengely mentén. Ez azt sugallja, hogy különböző trofikus tényezők működhetnek különböző helyeken ezen tengely mentén. Nemrégiben kimutattuk, hogy a TGF-alfa (TGF-α) szimulálja az enterocita forgalmat az epidermális növekedési faktor receptor expressziója szerint a villus-kriptatengely mentén (15).

Az elhízott génfehérje-termék, a leptin (LEP) kiválasztódik az adipocitákból, és elsősorban a hipotalamuszra hat, amely szabályozza az energiafelhasználást, az étel bevitelét és a testtömegét (16). Bár a belek nem a LEP klasszikus célszövetei, a különféle kísérleti modellekben végzett kiterjedt vizsgálatok kimutatták, hogy a LEP meghatározza a bél növekedésére, a sejtek érésére és a differenciálódásra gyakorolt ​​fontos fiziológiai hatásokat (17, 18). Korábbi munkánkban kimutattuk, hogy a LEP stimulálja a bél alkalmazkodását egy patkányon végzett hatalmas vékonybél-reszekció után (19). A pozitív hatás mögött meghúzódó mechanizmusokról azonban keveset tudunk.

Ennek a tanulmánynak a célja az volt, hogy megvizsgálja a LEP enterocitaforgalomra (proliferációra és apoptózisra) gyakorolt ​​hatásait az LEP-receptor (LEPr) expressziójával kapcsolatban a villus-kriptatengely mentén patkányokban a vékonybél hatalmas reszekciója után.

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

Állatok.

A Rappaport Orvosi Iskola (Technion, Haifa, Izrael) intézményi állatgondozási és -használati bizottsága jóváhagyta az állatok létesítményeit és protokolljait. 240-260 g tömegű hím felnőtt Sprague-Dawley patkányokat állandó rozsdamentes acél ketrecekben állandó hőmérsékleten és páratartalom mellett elhelyeztek, és 12 órás világos-sötét ciklust tartottak fenn. A patkányokat a kísérlet előtt 12 órán át böjtöltük szabad vízhez való hozzáféréssel. Az általános érzéstelenítést ketaminnal (ip 90 mg/kg) és xilazinnal (ip 15 mg/kg) kezdték meg.

Kísérleti terv.

40 patkányt véletlenszerűen a három csoport egyikébe soroltak: A csoportba, az álpatkányokat béltranszekciónak vetették alá (ál, n = 14); A B csoportba tartozó SBS állatokon átesett a bél reszekciója (SBS, n = 13); és a C csoportba tartozó SBS-LEP patkányokon átesett a bél reszekciója (SBS-LEP, n = 13), és LEP-vel kezeltük 50 mg/kg ip dózissal, d 4-től d 14-ig.

Sebészeti eljárás.

A patkányok a két műtéti eljárás egyikén estek át: béltranszekció, majd reanastomosis vagy 75% -os bélrezekció. Steril technikák alkalmazásával a hasat középvonalú bemetszéssel megnyitották. Álszent patkányoknál a középső vékonybél megszakadt és bél reszekció nélkül összeállt. Az előzőleg leírtakhoz hasonló, 75% közepes vékonybél reszekciót végeztek SBS állatokban. Ez a bél reszekciójából állt, a von Treitz-szalag 5 cm-es távolsága és az ileocecalis szelep 10 cm-es távolsága között. A bél folytonosságát end-to-end anastomosis helyreállította 6-0 felszívódó varrat alkalmazásával (Vicryl, Ethicon Corporation, USA). Valamennyi művelet során a hasüreget két rétegben lezártuk 3/0 Vicryl (Ethicon Corporation, USA) futóvarrattal. A posztoperatív patkányoknak ad libitum vizet és folyékony étrendet engedélyeztek. A patkányokat a 15. napon felöltük pentobarbitál (75 mg/kg) ip injekcióval.

A bél beállításának paraméterei.

A vékonybelet gyorsan eltávolították, hideg izotóniás sóoldattal átöblítették, és két szegmensre osztották: az anastomosis közelében lévő jejunumra és a terminális ileumra. A vastagbélt az antimesentericus határán hasítottuk, hideg sóoldattal mostuk, szárítottuk, és mindegyik szegmenst lemértük. A nyálkahártyát egy spatulával (Sigma Chemical Co., Izrael) kapartuk ki az alatta lévő szövetből. A nyálkahártya mintákat TRIzol reagenssel homogenizáltuk. A DNS-t és a fehérjét Chomczynski-módszerrel (20) extraháltuk, és mikrogrammban fejeztük ki a bél centiméterében/100 gramm testtömegben.

Szövettani vizsgálat.

Szövettani metszeteket készítettünk a proximális jejunumból, a distalis ileumból és a kontroll állatok hasonló helyeiről. A vékonybél szegmenseket 24 órán át 10% -os formalinban rögzítettük és standard paraffin blokkokká dolgoztuk fel. Öt mikronos szövetmetszetet festettünk hematoxilinnal és eozinnal. A Villi magasságát és a kriptamélységet Image Pro Plus 4 képelemző szoftverrel (Media Cybernetics, Baltimore, MD) mértük. Minden szakaszon tíz villit és kriptát mértünk, és az átlagolvasást mikrométerben rögzítettük.

Lézeres befogási mikrodisszekció és RNS előkészítés.

A 15 mikrométer vastag szakaszokat speciális RNáz-mentes és UV-kezelt membránnal borított tárgylemezekre (PALM Technologies, Bernried, Németország) helyeztük, és jéghideg 70% -os etanolban rögzítettük 2 percig. 60% -os inkubálás után 1% krezil-ibolya-acetátban a metszeteket etanol-sorozatban (70 és 100% jégen) dehidratáltuk, és rövid ideig száradni hagytuk. A tárgylemezeket mikrodisszekcióig -80 ° C-on tároltuk. A metszeteket 3 napon belül lézervágtuk. A tárgylemezeket fordított Zeiss Axiovert 200 M lézerrögzítő mikroszkóppal figyeltük meg, és PALM Robo szoftverrel monitoron jelenítettük meg. A villi tippeket, az oldalsó villusokat és a kriptákat lézerrel elválasztottuk. Az RNS-t az RNeasy Microkit (Qiagen) és a mikrodisszekciós protokoll alkalmazásával extraháltuk. Az összes mintát hosszú távú tárolás céljából -80 ° C-on tároltuk.

RT-PCR.

Az RNS minőségét az Experion (BioRad) automatizált elektroforézis rendszerrel értékeltük. Öt mikrogramm RNS-t fordítottunk cDNS-be 37 ° C-on 200 µM deoxinukleotidokkal (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 5 µM véletlenszerű hexamerekkel (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), 20 U RNAguard (Amersham Pharmacia Biotech) felhasználásával. átírva) és 200 E/μl Moloney egér leukémiavírus reverz transzkriptáz (US Biochemicals, Cleveland, OH). A termikus cikler beállításait optimalizálták annak biztosítására, hogy a termékek lineáris gyártási szakaszban legyenek.

Valós idejű PCR.

A LEPr-szintek hosszú formájának expresszióját kvantitatív, valós idejű PCR-rel határoztuk meg a cDNS-mintákon, az igény szerinti TaqMan assay segítségével (ABsolute Blue QPCR ROX Mix (ROX festék), ABgene, Epsom, Egyesült Királyság). az ABI-PRISM 7000 (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornia). Egyetlen exon-láncindítókat (a PrimerDesing Ltd-től, Egyesült Királyság) 3'UTR-1064 bp távolságra (sense primer, GCAGGGCTGTATGTCATTGTA; antiszensz-primert, GAACATGGTCCCAAAACAACTT) 109 bp-os amplikon előállítására fejlesztettünk ki. 18S-t (5'AGGAATTGACGGAAGGGCAC, 3'GTGCAGCCCCGGACATCTAAG) alkalmaztunk ugyanazon cDNS-terhelés eléréséhez minden kamrában. A primerek a LEPr hosszú formájára specifikusak, és nem azonos exonban vannak; Egyébként a szennyező DNS amplifikációja nem különböztethető meg a cDNS amplifikációjától.

A kriptasejtek szaporodása és az enterocita apoptózis.

A patkányoknak standard 5-bróm-oxi -uridin (5-BrdU) jelölő reagenst (Zymed Lab, Inc., CA) injektáltunk 1 ml/100 g testtömeg dózisban 2 órával az elpusztítás előtt. A szöveti szakaszokat (5 um) viaszmentesítettük xilollal, rehidratáltuk osztályozott alkohollal, és festettük egy biotinilezett anti-BrdU monoklonális antitest rendszerrel, a BrdU festő készlet segítségével (Zymed Lab, Inc., CA). A proliferációs indexet azon kriptasejtek arányaként határoztuk meg, amelyek 10 kriptánként pozitívak voltak a BrdU-ra.

További 5? A metszetek vastagok voltak az enterocita apoptózis mértékének meghatározásához. A kaszpáz-3 (kaszpáz-3 emésztett koncentrált poliklonális antitest; 1: 100 hígítás; Biocare Medical, Walnut Creek, Kalifornia) immunhisztokémiáját az apoptotikus sejtek megcélzásához sztreptovidin-biotin-peroxidáz módszer kombinációjával végeztük. Határozza meg a gyártót. A hámsejtek apoptózisának expresszióját az apoptotikus sejtek ezen tengely mentén számított összes számában fejezzük ki 10 villián és 100 kriptánként. Bizonyos esetekben az apoptózis helyének részletesebb elemzését korábban kialakított technikák alkalmazásával végezték el (21). Ebből a célból a villi mentén az apoptózist megkülönböztették a villi alsó harmada (laterális villi) és a villi felső harmada (villi tips) között. Az apoptózist az apoptotikus sejtek számának 10 villinként rögzítették. Szakképzett patológus, vakon a bélszövet forrására, minden mérést elvégzett.

Bax és Bcl-2 gének expressziója.

A teljes RNS-t fagyasztott nyálkahártya-mintákból (proximális jejunum és distalis ileum) izoláltuk TRIzol-reagens (GIBCO BRL, USA) alkalmazásával, Chomczynski (20) leírása szerint. A teljes RNS egy részét (2 µg 25 µl teljes térfogatban) megfordítottuk Moloney Murine Leukemia Virus (MMLV) első szálú cDNS szintézis készlet segítségével (Gene Choice, Inc. Frederick, MD). átírta. A PCR után az amplifikált terméket (5 ul) etidium-bromiddal festett 2% -os agarózgélen futtattuk és lefényképeztük. A Bax és Bcl-2 génexpresszió szintjét a célgén szürke sűrűségének és a 18S szürke sűrűségének arányában fejeztük ki a densitometriában. A specifikus gének szekvenciája a következő volt: Bax 5 'ATGGACGGGTCCGGGGCC, 3'ATGGACGGGTCCGGGGGCA, Bcl-2 5'TGAGGCCCTGTCTGCTTCTG, 3'AGGCTCCCGGGGCAGTCATGA (az összes primer magasabb volt, mint a Sigma Alma. Amikor az mRNS-ek nagy része expresszálódik, a 18S rRNS primereket 1:10 arányban hígítottuk, hogy az RT-PCR-termékek azonos exponenciális amplifikációs tartományba kerüljenek.

Statisztikai analízis.

Az adatokat átlag ± SEM-ben fejezzük ki. Egyirányú ANOVA tesztet, majd Bonferroni post hoc tesztet alkalmaztunk statisztikai elemzéshez p-értékkel

Kapcsolat a leptin receptor mRNS expressziója (B) és az enterocita proliferáció (A) és az apoptózis (C) között a kriptákban a vékonybél hatalmas reszekciója és leptinnel végzett kezelés után. Az értékek átlag ± SEM. Nagyítás 1: 100. * p

A bél reszekciójának és a leptinnel történő kezelés hatása az enterocita apoptózisra (B) a leptin receptor expresszióval (A) korrelációban a villusok csúcsaiban és az oldalsó villusokban. Az értékek átlag ± SEM. Nagyítás 1: 100. * p

A bélrezekció és a leptin kezelés hatása a Bax és a Bcl-2 expressziójára ileum nyálkahártya mintákban. Az értékek átlag ± SEM. * o. A morfológiai változások magukban foglalják a villiák meghosszabbodását és a kripták elmélyülését, fokozott enterocita proliferációt és az enterociták fokozott migrációját a villi mentén. A funkcionális adaptáció az izolált enterociták fokozott tápanyagfelvételéhez vezet (21–23).

A vizsgálat fő hibája, hogy csak a LEPr hosszú formájának mRNS-szintjét elemzik. További kísérletekre van szükség a LEPr egyéb olyan formáinak expressziójának értékeléséhez, amelyekről ismert, hogy a patkány különböző szöveteiben léteznek.

Összefoglalva, a LEP-kezelés stimulálja a bél növekedését az SBS patkánymodelljeiben. A villus-kriptatengely mentén megnövekedett LEPr mRNS-expresszió jelezheti a LEP releváns szerepét az enterocita apoptózis modulációjában a gyomor-bélrendszer nyálkahártyájában. A LEP hatása az enterocitaforgalomra szorosan korrelál a LEPr expresszió hosszú formájával a villi-kriptatengely mentén.

---